Utilisation d’oligonucléotides synthétiques modifiés pour doser des enzymes métabolisant des acides nucléiques

Toutes les formes de vie ont besoin d’enzymes de traitement des acides nucléiques pour mener à bien les processus biologiques fondamentaux, notamment la réplication, la transcription et la réparation de l’ADN. Les principales fonctionnalités enzymatiques de ces voies sont les polymérases, qui génèrent des copies de molécules d’ARN/ADN, les ligases qui se joignent aux substrats polynucléotidiques, les nucléases qui les dégradent, et les hélicases et topoisomérases, qui font fondre les duplex d’acide nucléique ou modifient leur topologie 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . De plus, bon nombre de ces enzymes fournissent des outils moléculaires essentiels pour des applications telles que le clonage, le diagnostic et le séquençage à haut débit 11,12,13,14,15.

Les caractéristiques fonctionnelles, la cinétique et les spécificités des substrats de ces enzymes peuvent être déterminées à l’aide de substrats d’ADN/ARN marqués produits par des oligonucléotides de recuit. Le suivi des substrats et des produits est traditionnellement réalisé par l’introduction d’un marqueur radioactif (³²P) à l’extrémité du brin 5′, qui peut ensuite être détecté par un film photographique ou à l’aide d’un système d’imagerie au phosphore^16,17. Bien que les substrats radiomarqués offrent l’avantage d’une sensibilité expérimentale accrue et ne modifient pas les propriétés chimiques d’un nucléotide, les risques potentiels pour la santé liés au travail avec des radio-isotopes ont encouragé le développement d’un marquage des acides nucléiques non radioactifs afin de fournir une alternative plus sûre pour la détection de l’ADN et de l’ARN 18,19,20 . Parmi ceux-ci, la détection de fluorescence, y compris la détection de fluorescence directe, la fluorescence résolue dans le temps et les tests de transfert d’énergie/extinction de fluorescence se distinguent comme les plus polyvalents 21,22,23,24. La vaste gamme de fluorophores permet différentes conceptions de substrats d’ADN/ARN avec des rapporteurs uniques sur chaque oligonucléotide²⁵. De plus, la stabilité des fluorophores, par rapport aux radio-isotopes, permet aux utilisateurs de produire et de préserver des quantités importantes de substrats d’ADN marqués par fluorescence¹⁹. Ces substrats marqués au fluorophore peuvent être incubés avec la protéine d’intérêt, ainsi que différentes combinaisons de cofacteurs métalliques et nucléotidiques, pour analyser la liaison et/ou l’activité enzymatique. La visualisation de la liaison ou de l’activité peut être observée à l’aide de divers canaux de colorant fluorophore avec un système d’imagerie sur gel. Comme seuls les oligonucléotides marqués par fluorescence seront visibles à l’aide de cette technique, toute augmentation ou diminution de la taille de l’oligonucléotide marqué sera facile à suivre. Les gels peuvent également être colorés par la suite, avec des colorants de coloration aux acides nucléiques pour visualiser toutes les bandes d’ADN présentes sur le gel.

Les ligases d’acides polynucléiques sont des enzymes qui joignent des fragments d’ADN/ARN, catalysant le scellement des cassures par la formation d’une liaison phosphodiester entre les terminaisons de l’ADN phosphorylé 5′ et les 3′ OH de l’ADN. Ils peuvent être divisés en deux groupes en fonction de leurs besoins en substrat nucléotidique. Les ligases dépendantes du NAD, hautement conservées, se trouvent dans toutes les bactéries²⁶, tandis que les enzymes dépendantes de l’ATP structurellement diverses peuvent être identifiées dans tous les domaines de la vie ^8,27. Les ligases d’ADN jouent un rôle important dans le traitement des fragments d’Okazaki pendant la réplication et sont impliquées dans diverses voies de réparation de l’ADN, telles que la réparation par excision de nucléotides et de bases, en scellant les entailles spontanées et les entailles laissées après la réparation ^8,10. Différentes ligases d’ADN présentent des capacités variables pour joindre différentes conformations de cassures d’ADN, y compris des entailles dans un duplex, des cassures double brin, des discordances et des lacunes, ainsi que des hybrides d’ARN et d’ADN 28,29,30. Une gamme variée de substrats ligaturables peut être assemblée en recuit d’oligonucléotides avec un phosphate 5′ pour générer des terminaisons 5′ et 3′ juxtaposées dans un duplex d’acide nucléique 31,32,33. La méthode d’analyse la plus courante est la résolution par PAGE d’urée dans un format de test final ; Cependant, les innovations récentes ont inclus l’utilisation de l’électrophorèse sur gel capillaire, qui permet un débit élevé³⁴, le profilage par spectrométrie de masse³⁵, ainsi qu’un test de balise moléculaire homogène, qui permet une surveillance résolue dans le temps³⁶.

La première étape d’une réaction de ligature est l’adénylation de l’enzyme ligase par l’adénosine triphosphate (ATP) ou le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD), ce qui donne un intermédiaire enzymatique covalent. La deuxième étape de la réaction est l’adénylation du substrat d’acide nucléique à l’extrémité 5′ du site de l’entaille, qui est suivie de la ligature des brins d’entaille d’acide nucléique. De nombreuses enzymes ligases qui sont exprimées de manière recombinante dans E. coli sont purifiées sous la forme adénylée et, par conséquent, sont capables de ligaturer avec succès les acides nucléiques sans l’ajout d’un cofacteur nucléotidique. Il est donc difficile de déterminer le type particulier de cofacteur nucléotidique dont ils ont besoin pour la ligature des acides nucléiques. En plus de décrire des tests permettant d’évaluer l’activité de l’ADN ligase, une méthode permettant de déterminer de manière fiable l’utilisation des cofacteurs en désadénylant l’enzyme à l’aide de substrats non marqués est également présentée.

Les nucléases sont un groupe vaste et diversifié d’enzymes modifiant l’ADN/ARN et d’ARN catalytiques qui clivent les liaisons phosphodiester entre les acides nucléiques³⁷. Les fonctionnalités de l’enzyme nucléase sont nécessaires à la réplication, à la réparation et au traitement de l’ARN et peuvent être classées en fonction de leur spécificité de sucre pour l’ADN, l’ARN ou les deux. Les endonucléases hydrolysent les liaisons phosphodiester à l’intérieur d’un brin d’ADN/ARN, tandis que les exonucléases hydrolysent les brins d’ADN/ARN un nucléotide à la fois à partir de l’extrémité 3′ ou 5′ et peuvent le faire à partir de l’extrémité 3′ à 5′ ou de l’extrémité 5′ à 3′ de l’ADN³⁸.

Alors que de nombreuses protéines nucléases sont non spécifiques et peuvent être impliquées dans plusieurs processus, d’autres sont très spécifiques pour une séquence particulière ou des dommages à l’ADN ^6,39,40. Les nucléases spécifiques à une séquence sont utilisées dans un large éventail d’applications biotechnologiques, telles que le clonage, la mutagénèse et l’édition du génome. Les nucléases populaires pour ces applications sont les nucléases de restriction⁴¹, les nucléases à doigts de zinc⁴², les nucléases effectrices de type activateur transcriptionnel et, plus récemment, les nucléases CRISPR⁴³ guidées par l’ARN. Des nucléases spécifiques aux dommages ont récemment été identifiées, telles que la nucléase EndoMS, qui a une spécificité pour les mésappariements dans l’ADN grâce à son domaine nucléase de type RecB spécifique aux mésappariements ^5,44. Historiquement, les essais d’activité des nucléases ont été effectués sous forme d’essais discontinus avec des substrats radiomarqués ; Cependant, en plus de leurs autres inconvénients, ceux-ci ne permettent pas d’identifier le site qui est coupé par une protéine nucléase, ce qui est possible lors de l’utilisation de substrats marqués par fluorescence^45,46. Plus récemment, des tests de nucléases continues ont été mis au point et fonctionnent en utilisant différents colorants d’ADN qui interagissent avec l’ADN dans différents états ; par exemple, émettre un signal fluorescent plus élevé lors de l’interaction avec l’ADNdb qu’à l’état non lié, ou se lier spécifiquement à des ARN courts⁴⁷. D’autres tests de nucléases continues utilisent des épingles à cheveux d’ADN avec un groupe fluorophore à l’extrémité 5′ et un quencher à l’extrémité 3′, de sorte que la fluorescence augmente à mesure que l’oligonucléotide est dégradé en raison d’une séparation du fluorophore et du quencher⁴⁸. Bien que ces tests permettent de caractériser la cinétique des protéines dégradant l’ADN, ils nécessitent une connaissance préalable de la fonction et du substrat de l’enzyme et sont également limités aux enzymes qui modifient la conformation de l’ADN pour provoquer une différence dans la liaison du colorant. Pour cette raison, les tests de paramètres qui résolvent les produits nucléases individuels sont toujours souhaitables pour fournir un aperçu des modifications de l’ADN causées par l’activité des protéines.

Ici, une procédure détaillée est présentée pour la conception d’oligonucléotides d’ADN/ARN marqués par fluorescence qui peuvent être mélangés et appariés pour générer des substrats permettant de tester l’activité de nouvelles enzymes nucléases, polymérases et ligases. La validation de cet ensemble de base de séquences d’oligonucléotides simplifie la conception expérimentale et facilite le profilage économique d’un large éventail de fonctionnalités enzymatiques sans avoir besoin d’acheter un grand nombre de substrats sur mesure. Une procédure détaillée est fournie pour l’exécution d’un test enzymatique standard de traitement de l’ADN avec ces substrats, en utilisant l’exemple de l’activité de l’ADN ligase et des modifications pour le dosage et l’analyse des enzymes nucléases et polymérases sont décrites. De plus, un test modifié pour déterminer la spécificité du cofacteur de l’enzyme ADN ligase avec une grande précision est fourni, et des sondes à double marquage sont utilisées pour évaluer l’assemblage de ligatures à plusieurs composants. Enfin, des modifications au format de base de l’essai sont discutées pour permettre son utilisation pour déterminer les interactions protéine-ADN avec les mêmes substrats par l’essai de déplacement de mobilité électrophorétique (EMSA).