Gebruik van gemodificeerde synthetische oligonucleotiden om nucleïnezuurmetaboliserende enzymen te testen

Alle levensvormen hebben nucleïnezuurverwerkende enzymen nodig om fundamentele biologische processen uit te voeren, waaronder replicatie, transcriptie en DNA-reparatie. De belangrijkste enzymatische functionaliteiten voor deze routes zijn polymerasen, die kopieën van RNA/DNA-moleculen genereren, ligases die zich aansluiten bij polynucleotidesubstraten, nucleasen die ze afbreken, en helicasen en topoisomerasen, die nucleïnezuurduplexen smelten of hun topologie veranderen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Bovendien bieden veel van deze enzymen essentiële moleculaire hulpmiddelen voor toepassingen zoals klonen, diagnostiek en high-throughput sequencing 11,12,13,14,15.

De functionele kenmerken, kinetiek en substraatspecificiteiten van deze enzymen kunnen worden bepaald met behulp van gelabelde DNA/RNA-substraten die worden geproduceerd door oligonucleotiden te gloeien. Het traceren van substraten en producten wordt van oudsher bereikt door het aanbrengen van een radioactief label (³²P) aan het uiteinde van de 5′-streng, dat vervolgens kan worden gedetecteerd met fotografische film of met een fosforbeeldvormingssysteem^16,17. Hoewel radioactief gelabelde substraten het voordeel bieden van een verhoogde experimentele gevoeligheid en de chemische eigenschappen van een nucleotide niet veranderen, hebben de potentiële gezondheidsrisico’s van het werken met radio-isotopen de ontwikkeling van niet-radioactieve nucleïnezuuretikettering aangemoedigd om een veiliger alternatief te bieden voor DNA- en RNA-detectie 18,19,20 . Hiervan vallen fluorescentiedetectie, inclusief directe fluorescentiedetectie, tijdopgeloste fluorescentie en energieoverdracht/fluorescentie-afschriktesten op als de meest veelzijdige 21,22,23,24. Het uitgebreide scala aan fluoroforen maakt verschillende ontwerpen van DNA/RNA-substraten mogelijk met unieke reporters op elk oligonucleotide²⁵. Bovendien stelt de stabiliteit van fluoroforen, in vergelijking met radio-isotopen, gebruikers in staat om aanzienlijke hoeveelheden fluorescerend gelabelde DNA-substraten te produceren en te bewaren¹⁹. Deze met fluorofoor gelabelde substraten kunnen worden geïncubeerd met het eiwit van belang, samen met verschillende combinaties van metaal- en nucleotide-cofactoren, om bindings- en/of enzymactiviteit te analyseren. Visualisatie van binding of activiteit kan worden waargenomen met behulp van verschillende fluorofoorkleurkanalen met een gelbeeldvormingssysteem. Aangezien met deze techniek alleen de fluorescerend gelabelde oligonucleotiden zichtbaar zullen zijn, zal elke toename of afname van de grootte van het gelabelde oligonucleotide gemakkelijk te volgen zijn. Gels kunnen daarna ook worden gekleurd, met nucleïnezuurkleuringskleurstoffen om alle DNA-banden die op de gel aanwezig zijn te visualiseren.

Polynucleïnezuurligases zijn enzymen die fragmenten van DNA/RNA samenvoegen en de afdichting van breuken katalyseren door de vorming van een fosfodiësterbinding tussen 5′ gefosforyleerde DNA-termini en de 3′ OH van DNA. Ze kunnen in twee groepen worden verdeeld op basis van hun nucleotidesubstraatvereiste. De sterk geconserveerde NAD-afhankelijke ligases worden aangetroffen in alle bacteriën²⁶, terwijl de structureel diverse ATP-afhankelijke enzymen in alle domeinen van het leven kunnen worden geïdentificeerd ^8,27. DNA-ligases spelen een belangrijke rol bij de verwerking van Okazaki-fragmenten tijdens replicatie en zijn ook betrokken bij verschillende DNA-herstelroutes, zoals nucleotide- en base-excisiereparatie, door het afdichten van spontane inkepingen en inkepingen die overblijven na reparatie ^8,10. Verschillende DNA-ligases vertonen verschillende capaciteiten om verschillende conformaties van DNA-breuken te verbinden, waaronder inkepingen in een duplex, dubbelstrengs breuken, mismatches en hiaten, evenals RNA- en DNA-hybriden 28,29,30. Een breed scala aan ligeerbare substraten kan worden geassembleerd door oligonucleotiden te gloeien met een 5′-fosfaat om naast elkaar geplaatste 5′- en 3′-termini te genereren in een nucleïnezuurduplex 31,32,33. De meest gebruikelijke analysemethode is resolutie door ureum PAGE in een eindpuntanalyseformaat; Recente innovaties zijn echter het gebruik van capillaire gelelektroforese, die een hoge doorvoer mogelijk maakt³⁴, massaspectrometrische profilering³⁵, evenals een homogene moleculaire bakentest, die tijdopgeloste monitoring mogelijk maakt³⁶.

De eerste stap in een ligatiereactie is de adenylering van het ligase-enzym door adenosinetrifosfaat (ATP) of nicotinamide-adeninedinucleotide (NAD), wat resulteert in een covalent enzymtussenproduct. De tweede stap in de reactie is adenylering van het nucleïnezuursubstraat aan het 5′-uiteinde van de nick-plaats, gevolgd door ligatie van de nucleïnezuur-nick-strengen. Veel ligase-enzymen die recombinant tot expressie worden gebracht in E. coli worden gezuiverd in de geadenyleerde vorm en zijn daarom in staat om nucleïnezuren met succes te ligeren zonder de toevoeging van een nucleotide-cofactor. Dit maakt het moeilijk om te bepalen welk specifiek type nucleotide-cofactor ze nodig hebben voor de ligatie van nucleïnezuren. Naast het beschrijven van assays om de activiteit van DNA-ligase te evalueren, wordt ook een methode gepresenteerd om het cofactorgebruik betrouwbaar te bepalen door het enzym te de-adenyleren met behulp van niet-gelabelde substraten.

Nucleasen zijn een grote en diverse groep DNA/RNA-modificerende enzymen en katalytische RNA’s die de fosfodiësterbindingen tussen nucleïnezuren splitsen³⁷. Nuclease-enzymfunctionaliteiten zijn vereist bij DNA-replicatie, -reparatie en RNA-verwerking en kunnen worden geclassificeerd op basis van hun suikerspecificiteit voor DNA, RNA of beide. Endonucleasen hydrolyseren de fosfodiësterbindingen binnen een DNA/RNA-streng, terwijl exonucleasen DNA/RNA-strengen één nucleotide tegelijk hydrolyseren vanaf het 3′ of 5′ uiteinde en dit kunnen doen van het 3′ tot 5′ of het 5′ tot 3′ uiteinde van het DNA³⁸.

Hoewel veel nuclease-eiwitten niet-specifiek zijn en bij meerdere processen betrokken kunnen zijn, zijn andere zeer specifiek voor een bepaalde sequentie of DNA-schade ^6,39,40. Sequentiespecifieke nucleasen worden gebruikt in een breed scala aan biotechnologische toepassingen, zoals klonen, mutagenese en genoombewerking. Populaire nucleasen voor deze toepassingen zijn restrictienucleasen⁴¹, zinkvingernucleasen⁴², transcriptionele activator-achtige effectornucleasen en meest recentelijk de RNA-geleide gemanipuleerde CRISPR-nucleasen⁴³. Schadespecifieke nucleasen zijn onlangs geïdentificeerd, zoals het EndoMS-nuclease, dat specifiek is voor mismatches in het DNA via zijn mismatch-specifieke RecB-achtige nucleasedomein ^5,44. Nuclease-activiteitstesten zijn in het verleden uitgevoerd als discontinue tests met radioactief gelabelde substraten; Naast hun andere nadelen maken deze echter niet de identificatie mogelijk van de plaats die wordt doorsneden door een nuclease-eiwit, wat mogelijk is bij gebruik van fluorescerend geëtiketteerde substraten^45,46. Meer recentelijk zijn continue nuclease-assays ontwikkeld die werken door verschillende DNA-kleurstoffen te gebruiken die in verschillende toestanden met DNA interageren; bijvoorbeeld het uitzenden van een hoger fluorescerend signaal bij interactie met dsDNA dan in zijn ongebonden toestand, of specifiek binden aan korte RNA’s⁴⁷. Andere continue nucleasetesten maken gebruik van DNA-haarspelden met een fluorofoorgroep aan de 5′ en een quencher aan het 3′-uiteinde, zodat de fluorescentie toeneemt naarmate het oligonucleotide wordt afgebroken als gevolg van een scheiding van de fluorofoor en de quencher⁴⁸. Hoewel deze tests het mogelijk maken om de kinetiek van DNA-afbrekende eiwitten te karakteriseren, vereisen ze voorkennis van de functie en het substraat van het enzym en zijn ze ook beperkt tot enzymen die de DNA-conformatie veranderen om een verschil in kleurstofbinding te veroorzaken. Om deze reden zijn endpoint-assays die individuele nucleaseproducten oplossen nog steeds wenselijk om inzicht te geven in DNA-modificaties veroorzaakt door eiwitactiviteit.

Hier wordt een gedetailleerde procedure gepresenteerd voor het ontwerp van fluorescerend gelabelde DNA/RNA-oligonucleotiden die kunnen worden gemengd en gematcht om substraten te genereren voor het testen van de activiteit van nieuwe nuclease-, polymerase- en ligase-enzymen. De validatie van deze basisset van oligonucleotidesequenties vereenvoudigt het experimentele ontwerp en vergemakkelijkt de economische profilering van een breed scala aan enzymatische functionaliteiten zonder dat een groot aantal op maat gemaakte substraten hoeft te worden aangeschaft. Er wordt een gedetailleerde procedure gegeven voor het uitvoeren van een standaard DNA-verwerkende enzymtest met deze substraten, met behulp van het voorbeeld van DNA-ligase-activiteit en modificaties voor het testen en analyseren van nuclease- en polymerase-enzymen worden beschreven. Bovendien wordt een gewijzigde test gegeven voor het bepalen van de cofactorspecificiteit van het DNA-ligase-enzym met hoge nauwkeurigheid, en worden dubbel gelabelde sondes gebruikt om de assemblage van ligaties met meerdere componenten te evalueren. Ten slotte worden aanpassingen aan het basistestformaat besproken om het mogelijk te maken om eiwit-DNA-interacties met dezelfde substraten te bepalen door middel van de elektroforetische mobiliteitsverschuivingstest (EMSA).