マウス海馬歯状回における顆粒細胞のin vivoカルシウムイメージング

これまでの研究では、海馬は記憶の処理や想起に不可欠な脳の構造であることがわかっています^1,2。1950年代以降、げっ歯類の海馬の神経回路は、記憶の形成、保存、および検索の研究において焦点となってきました³。海馬内の解剖学的構造には、歯状回(DG)、CA1、CA2、CA3、CA4、およびsubiculum⁴の亜領域が含まれます。これらのサブリージョン間には複雑な双方向の接続が存在し、そのうちDG、CA1、およびCA3は、顆粒細胞と錐体細胞⁵からなる顕著な三シナプス回路を形成しています。この回路は、嗅内皮質(EC)から主要な入力を受け取り、シナプスの可塑性を研究するための古典的なモデルとなっています。海馬機能に関する以前のin vivo研究は、そのアクセスの容易さから、主にCA1 ^6,7に集中していました。CA1ニューロンは、記憶の形成、固定、および検索において重要な役割を果たしますが、特に空間記憶のための細胞では、海馬の他のサブ領域も重要です^8,9。特に、最近の研究では、記憶形成におけるDGの機能が注目されています。DGの場所細胞はCA1¹⁰の場所細胞よりも安定していることが報告されており、その活動は状況特異的な情報を反映している¹¹。さらに、DG顆粒細胞の活性依存的な標識は、記憶関連の行動を誘導するために再活性化することができる¹²。したがって、DGの情報コーディングをより深く理解するためには、動物が記憶依存的なタスクを実行している間のDG亜領域の活動を調査することが重要です。

DG活性に関する先行研究では、主に in vivo 電気生理学¹³が用いられてきた。しかし、この手法にはいくつかの欠点があります:まず、電気記録では、シグナルを生成しているさまざまな種類の細胞を直接特定することが難しい場合があります。記録されたシグナルは、抑制性細胞と興奮性細胞の両方からのものです。したがって、これら2つの細胞タイプを分離するためには、さらなるデータ処理方法が必要となる。さらに、プロジェクション特異的なサブグループや活性依存的な標識など、他の細胞型情報を電気記録と組み合わせることは困難です。さらに、DGの解剖学的形態により、記録電極は直交方向に埋め込まれることが多く、記録できるニューロンの数が大幅に制限されます。したがって、電気記録が同一動物¹⁴のDG構造から数百の個々のニューロンをモニタリングすることは困難である。

DGにおけるニューロン活動を記録する補完的な技術は、 in vivo カルシウムイメージング¹⁵を使用することである。カルシウムイオンは、生物の細胞シグナル伝達プロセスの基本であり、特に哺乳類の神経系における多くの生理学的機能において重要な役割を果たしています。ニューロンが活動しているとき、細胞内のカルシウム濃度は急速に増加し、これはニューロンの活動とシグナル伝達の動的な性質を反映しています。したがって、ニューロンの細胞内カルシウムレベルのリアルタイムな変化を記録することは、神経コードメカニズムに関する重要な洞察を提供します。

カルシウムイメージング技術は、特殊な蛍光色素または遺伝子組み換えカルシウムインジケーター(GECI)を利用して、蛍光強度の変化を検出することによりニューロン内のカルシウムイオン濃度をモニターし、それを顕微鏡イメージング¹⁶で捉えることができる。一般に、緑色蛍光タンパク質(GFP)、カルモジュリン、およびM13ポリペプチド配列を含むカルシウム指標遺伝子のGCaMPファミリーが採用されます。GCaMPは、カルシウムイオン¹⁷に結合すると緑色蛍光を発することができ、緑色蛍光の変動をイメージング¹⁸を通じて記録することができる。さらに、標的の脳領域の鮮明な画像を得るために、通常、グラディエントインデックスレンズ(GRINレンズ)を関心領域の上に埋め込む。GRINレンズは、表面から直接アクセスできない脳深部領域のイメージングを可能にします。

この手法は、他の遺伝ツールと組み合わせて、さまざまな細胞タイプを標識するのに比較的簡単です。さらに、イメージング面はDGの細胞の向きと平行であるため、手術が成功するたびに数百のニューロンがイメージングに利用できます。この研究では、マウスの歯状回における in vivo カルシウムイメージングのための完全で詳細な手術プロトコルを紹介します(図1)。この手順には、2つの主要な操作が含まれます。1つ目は、AAV-CaMKIIα-GCaMP6fウイルスをDGに注入することです。2つ目の手術は、ウイルス注入部位の上にGRINレンズを埋め込むことです。これら2つの手順は、同じ座り方で行われます。これらの手術から回復した後、次のステップは、小型顕微鏡(ミニスコープ)でイメージング品質を確認することです。イメージングフィールドに数百の活性細胞がある場合、その後の手順は、歯科用セメントを使用してミニスコープベースプレートをマウスの頭蓋骨に取り付けることです。その後、マウスをイメージング実験に使用できます。また、収集されたカルシウムデータの解析を効率化するためのMATLABベースの前処理パイプラインについても紹介します。