Summary

Différenciation et caractérisation des ostéoclastes à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines

Published: March 22, 2024
doi:

Summary

Ce protocole présente la différenciation des ostéoclastes humains à partir des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) et décrit des méthodes de caractérisation des ostéoclastes et des précurseurs d’ostéoclastes.

Abstract

Ce protocole détaille la propagation et le passage des cellules iPS humaines et leur différenciation en ostéoclastes. Tout d’abord, les cellules iPS sont dissociées en une suspension unicellulaire pour une utilisation ultérieure dans l’induction du corps embryoïde. Après induction mésodermique, les corps embryoïdes subissent une différenciation hématopoïétique, produisant une population de cellules hématopoïétiques flottantes. Par la suite, les cellules hématopoïétiques récoltées subissent une étape de maturation du facteur de stimulation des colonies de macrophages et, enfin, une différenciation des ostéoclastes. Après différenciation des ostéoclastes, les ostéoclastes sont caractérisés par une coloration pour TRAP en conjonction avec une coloration nucléaire au vert de méthyle. Les ostéoclastes sont observés sous forme de polycaryons multinucléés TRAP+. Leur identification peut être renforcée par la coloration à la cathepsine K. Les tests de résorption osseuse et minérale permettent une caractérisation fonctionnelle, confirmant l’identité d’ostéoclastes authentiques. Ce protocole démontre une méthode robuste et polyvalente pour différencier les ostéoclastes humains des cellules iPS et permet une adoption facile dans les applications nécessitant de grandes quantités d’ostéoclastes humains fonctionnels. Des applications dans les domaines de la recherche sur les os, du cancer, de l’ingénierie tissulaire et de la recherche sur les endoprothèses pourraient être envisagées.

Introduction

Les ostéoclastes (OC) sont des types cellulaires polyvalents dérivés de l’hématopoïétique 1,2 qui sont couramment utilisés par les chercheurs dans des domaines tels que la recherche sur les maladies osseuses 3,4, la recherche sur le cancer 5,6, l’ingénierie tissulaire 7,8 et la recherche sur les endoprothèses 9,10. Néanmoins, la différenciation des CO peut être difficile car la fusion des précurseurs mononucléaires en CO multinucléés est nécessaire pour créer des CO fonctionnels11. Plusieurs facteurs biologiques, tels que l’activateur du récepteur du ligand NF-κB (RANKL) et le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF), sont nécessaires à la différenciation du CO. Il a été rapporté que le M-CSF a un effet positif sur la prolifération cellulaire, la survie cellulaire et l’expression de RANK 12,13,14. D’autre part, RANKL se lie à RANK, qui active des cascades de signalisation en aval qui induisent l’ostéoclastogenèse. L’activation est médiée par le facteur 6 associé au récepteur TNF (TRAF6), qui conduit à la dégradation du facteur nucléaire de l’activateur du gène polypeptidique léger kappa dans l’inhibiteur des lymphocytes B, alpha (IκB-α), une protéine de liaison qui se lie aux dimères NF-kB16,17. Par conséquent, la dégradation de l’IκB-α libère des dimères NF-kB, qui se transloquent ensuite dans le noyau et induisent l’expression des facteurs de transcription c-Fos et Nuclear Factor of Activated T-Cells 1 (NFATc1). Ceci, à son tour, déclenche la transcription d’une multitude de protéines liées à la différenciation OC 15,18. Des protéines régulées à la hausse telles que DC-Stamp et Atp6v0d2 interviennent dans la fusion cellule-cellule des précurseurs de CO, conduisant à la formation de syncytium 19,20,21.

En ce qui concerne les cellules primaires humaines, les PBMC CD34+ et CD14+ sont actuellement les types de cellules les plus utilisés pour la différenciation en OC22. Cependant, cette approche est limitée par l’hétérogénéité au sein de la population CD34+ des cellules prélevées sur des donneurs23 et leur capacité d’extensibilité limitée. Les CSPi humaines constituent une source alternative de CO. Comme ils peuvent être propagésindéfiniment 24, ils permettent l’évolutivité et la mise à l’échelle de la production de CO. Cela permet de différencier un grand nombre de CO, ce qui facilite la recherche sur les CO.

Plusieurs protocoles pour la différenciation des CSPi en CO ont été publiés 25,26,27. L’ensemble du processus de différenciation peut être divisé en une partie de propagation des CSPi, une partie de différenciation mésodermique et hématopoïétique et une partie de différenciation des CO. La propagation des cellules iPS avant le processus de différenciation permet la mise à l’échelle de la production de CO avant la différenciation. Plusieurs approches existent en ce qui concerne la différenciation mésodermique et hématopoïétique. Traditionnellement, la formation du corps embryoïde (EB) a été utilisée pour différencier les cellules hématopoïétiques, mais les approches basées sur des monocouches représentent une autre stratégie de différenciation hématopoïétique qui ne nécessite pas d’induction EB. Néanmoins, les systèmes monocouches semblent nécessiter une optimisation supplémentaire, car nous et d’autres avons constaté que les approches basées sur l’EB étaient plus robustes pour la différenciation des OC.

Ici, nous décrivons la différenciation des CO des iPSC humains à l’aide d’un protocole basé sur EB. Ce protocole a été adapté de Rössler et al.26 et modifié pour augmenter la robustesse et permettre la cryoconservation pendant le processus de différenciation. Tout d’abord, nous n’avons récolté des cellules hématopoïétiques qu’une seule fois après 10 jours de différenciation. Les cellules hématopoïétiques ont ensuite été cryoconservées pour permettre une plus grande flexibilité pendant le processus de différenciation. De plus, nous avons augmenté la densité d’ensemencement des cellules hématopoïétiques de 1 x 105 à 2 x 105 cellules/cm2 pour la différenciation du CO. Un milieu humain sans sérum iPSC plus récent (hiPSC-SFM, voir le tableau des matériaux) a été utilisé, et le revêtement des puits a été effectué avec 200 à 300 μg/mL d’un extrait de membrane basale (voir le tableau des matériaux) au lieu de 0,1 % de gélatine. La pénicilline/streptomycine n’a pas été ajoutée aux médias.

Le protocole de Rössler et al.26 a été adapté à l’origine d’une CSPi à un protocole de différenciation des macrophages28 qui utilise la formation d’EB pour la différenciation hématopoïétique. Bien que la formation d’EB ait été utilisée pendant une longue période par les chercheurs pour la différenciation hématopoïétique29,30, plusieurs méthodes d’induction d’EB ont été décrites dans la littérature, telles que l’agrégation spontanée, la centrifugation dans une plaque à fond rond, la culture de gouttes suspendues, la culture de bioréacteurs, la culture de tubes coniques, les vaisseaux latéraux à rotation lente et la culture de gel de micromoules31. Ce protocole utilise la centrifugation de cellules iPS dissociées dans une plaque à puits à fond rond pour rapprocher les cellules iPSC individuelles les unes des autres et permettre la formation de sphères (EB), comme décrit ci-dessous.

Protocol

REMARQUE : Tous les réactifs utilisés dans ce protocole se trouvent dans la table des matériaux. Sauf indication contraire, tous les milieux ont été pré-équilibrés à 37 °C avant utilisation. Toutes les étapes de centrifugation sont effectuées à 37 °C et en utilisant le mode d’accélération/décélération le plus lent. Sauf indication contraire, le surnageant est toujours éliminé à l’aide de pipettes jetables en verre Pasteur. 1. Décongélation et …

Representative Results

Suivi de la morphologie cellulaire tout au long du processus de différenciationTous les résultats décrits ci-dessous ont été générés à l’aide de la lignée MCND-TENS2 iPSC pour la différenciation OC. Cette lignée iPSC a déjà été utilisée dans plusieurs études 32,33. Néanmoins, d’autres lignées iPSC ont également été utilisées avec succès avec ce protocole de différenciation. L’évalua…

Discussion

Ce protocole offre une méthode fiable et robuste pour différencier les cellules iPS en CO. Néanmoins, il existe plusieurs pièges qui peuvent être rencontrés tout au long du processus de différenciation. Des lignées de CSPi humaines générées à partir de cellules d’origines tissulaires différentes ont été différenciées avec succès à l’aide de ce protocole33. Lors de la congélation des cellules iPS (voir l’étape de protocole « 3. Congélation des cellules iPS »), un puits…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire Giachelli pour leur aide technique et leur soutien. Nous remercions le Centre de microscopie W. M. Keck et le directeur du Centre Keck, le Dr Nathanial Peters, pour leur aide dans l’obtention des images de microscopie confocale et de microscopie à grand champ. Nous remercions également l’UW Flow Core Facility et le directeur de Flow Core Facility, Aurelio Silvestroni, pour leur soutien technique et leur assistance. Enfin, nous remercions Hannah Blümke pour son soutien en matière d’illustration et de conception graphique.

Le financement a été fourni par le biais de la subvention R35 HL139602-01 des National Institutes of Health. Nous remercions également la subvention S10 S10 OD016240 du NIH pour le financement des instruments au W. M. Keck Center, ainsi que la subvention 1S10OD024979-01A1 des NIH pour le financement des instruments de l’UW Flow Core Facility.

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M6250-10ML
Antibody – Anti-Cathepsin K  Abcam ab19027
Antibody – APC-conjugated Anti-Human CD45 BD 555485
Antibody – APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control BD 555751
Antibody – BV711-conjugated Anti-Human CD14 BD 563372
Antibody – BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control BD 563125
Antibody – Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647 Abcam ab150079
Antibody – PE-conjugated Anti-Human CD14 R&D Systems FAB3832P-025
Antibody – PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b R&D Systems FAB16991P-025
Antibody – PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34 BD 560710
Antibody – PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control BD 557872
Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b Biolegend 301308
Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl Biolegend 400118
Antibody – PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control BD 550795
Antibody – PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43 BD 563521
Bone Resorption Assay Kit CosmoBioUSA CSR-BRA-24KIT
Countess 3 Automated Cell Counter ThermoFisher 16812556
Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract R&D Sytems 3434-010-02 Basal membrane extract
DAPI R&D Systems 5748/10
Dispase (5 U/mL) STEMCELL Technologies 7913
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES Stem Cell 36254
DMSO Sigma Aldrich D2650
DPBS Sigma Aldrich D8537-500ML
Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4) STEMCELL Technologies 78211
Human IL-3 STEMCELL Technologies 78146.1
Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF) STEMCELL Technologies 78150.1
Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL) STEMCELL Technologies 78214.1
Human Stem Cell Factor (hSCF) STEMCELL Technologies 78155.1
Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) Biolegend 422301
Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165) STEMCELL Technologies 78073
Invitrogen Rhodamine Phalloidin Invitrogen R415
MEM α, nucleosides, no phenol red ThermoFisher 41061029
mFreSR STEMCELL Technologies 05855 Serum free cryopreservation medium
mTeSR Plus medium STEMCELL Technologies 100-0276 Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM)
Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate Thermo Scientific 174925 Round bottom ultra-low attachment 96-well plate
P1000 Wide Bore Tips ThermoFisher 2079GPK
ROCK-Inhibitor Y-27632 STEMCELL Technologies 72304
StemSpan SFEM StemCell 09650 Hematopoietic cell culture medium
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red Thermo Fisher 12563011 Single-cell dissociation reagent
Ultraglutamine Bioscience Lonza BE17-605E/U1
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Bioscience Lonza 04-418Q Hematopoietic basal medium
µ-Slide 8 Well High Ibidi 80806

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Citazione di questo articolo
Blümke, A., Simon, J., Leber, E., Scatena, M., Giachelli, C. M. Differentiation and Characterization of Osteoclasts from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (205), e66527, doi:10.3791/66527 (2024).

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