İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Osteoklastların Farklılaşması ve Karakterizasyonu
Summary
Bu protokol, insan osteoklastlarının indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC’ler) ayırt edilmesini sunar ve osteoklastların ve osteoklast öncüllerinin karakterizasyonu için yöntemleri açıklar.
Abstract
Bu protokol, insan iPSC’lerinin yayılmasını ve geçişini ve bunların osteoklastlara farklılaşmasını detaylandırır. İlk olarak, iPSC’ler, embriyoid vücut indüksiyonunda daha fazla kullanım için tek hücreli bir süspansiyona ayrıştırılır. Mezodermal indüksiyonu takiben, embriyoid cisimler hematopoietik farklılaşmaya uğrar ve yüzen bir hematopoietik hücre popülasyonu üretir. Daha sonra, hasat edilen hematopoietik hücreler bir makrofaj kolonisi uyarıcı faktör olgunlaşma adımına ve son olarak osteoklast farklılaşmasına tabi tutulur. Osteoklast farklılaşmasından sonra, osteoklastlar, metil yeşil nükleer boyama ile birlikte TRAP için boyama ile karakterize edilir. Osteoklastlar çok çekirdekli, TRAP+ polikaryonlar olarak gözlenir. Kimlikleri Katepsin K boyama ile daha da desteklenebilir. Kemik ve mineral rezorpsiyon deneyleri, iyi niyetli osteoklastların kimliğini doğrulayan fonksiyonel karakterizasyona izin verir. Bu protokol, insan osteoklastlarını iPSC’lerden ayırt etmek için sağlam ve çok yönlü bir yöntem gösterir ve büyük miktarlarda fonksiyonel insan osteoklastı gerektiren uygulamalarda kolay benimsenmeye izin verir. Kemik araştırmaları, kanser araştırmaları, doku mühendisliği ve endoprotez araştırmaları alanlarında uygulamalar öngörülebilir.
Introduction
Osteoklastlar (OK’ler) hematopoetik kaynaklı 1,2, kemik hastalığı araştırmaları 3,4, kanser araştırmaları 5,6, doku mühendisliği 7,8 ve endoprotez araştırmaları 9,10 gibi alanlarda araştırmacılar tarafından yaygın olarak kullanılan çok yönlü hücre tipleridir. Bununla birlikte, fonksiyonel OC’ler oluşturmak için mononükleer öncüllerin çok çekirdekli OC’lere füzyonu gerektiğinden, OC farklılaşması zor olabilir11. OK farklılaşması için NF-κB ligandının reseptör aktivatörü (RANKL) ve makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) gibi çeşitli biyolojik faktörler gereklidir. M-CSF’nin hücre proliferasyonu, hücre sağkalımı ve RANK ekspresyonu üzerinde olumlu bir etkisi olduğu bildirilmiştir 12,13,14. Öte yandan, RANKL, osteoklastogenezi indükleyen aşağı akış sinyal kaskadlarını aktive eden RANK’a bağlanır. Aktivasyona, NF-kB dimerlerini16,17 bağlayan bir bağlayıcı protein olan B hücreleri inhibitörü, alfa (IκB-α) kappa hafif polipeptit gen arttırıcının nükleer faktörünün bozulmasına yol açan TNF reseptörü ile ilişkili faktör 6 (TRAF6) aracılık eder. Bu nedenle, IκB-α bozunması, daha sonra çekirdeğe yer değiştiren ve transkripsiyon faktörleri c-Fos ve Aktive T-Hücreleri 1’in (NFATc1) Nükleer Faktörünün ekspresyonunu indükleyen NF-kB dimerlerini serbest bırakır. Bu da, çok sayıda OC farklılaşması ile ilgili proteinintranskripsiyonunu tetikler 15,18. DC-Stamp ve Atp6v0d2 gibi yukarı regüle proteinler, OC öncüllerinin hücre-hücre füzyonuna aracılık ederek sinsityum oluşumuna yol açar 19,20,21.
İnsan primer hücreleri ile ilgili olarak, CD34+ ve CD14+ PBMC’ler şu anda OC’lere farklılaşma için en yaygın kullanılan hücre tipleridir22. Bununla birlikte, bu yaklaşım, donörlerden23 toplanan hücrelerin CD34+ popülasyonundaki heterojenlik ve bunların sınırlı genişletilebilirliği ile sınırlıdır. İnsan iPSC’leri, OC’ler için alternatif bir kaynak sunar. Süresiz olarak 24 yayılabildikleri için, OC üretiminin genişletilebilirliğine ve ölçeklendirilmesine izin verirler. Bu, OC araştırmasını kolaylaştıran çok sayıda OC’nin farklılaşmasına izin verir.
iPSC’lerin OC’lere farklılaşması için çeşitli protokoller yayınlanmıştır 25,26,27. Tüm farklılaşma süreci bir iPSC yayılım bölümüne, bir mezodermal ve hematopoietik farklılaşma bölümüne ve OC farklılaşmasına ayrılabilir. iPSC’lerin farklılaşma sürecinden önce yayılması, farklılaşmadan önce OC üretiminin yükseltilmesine olanak tanır. Mezodermal ve hematopoetik farklılaşma ile ilgili çeşitli yaklaşımlar mevcuttur. Geleneksel olarak, hematopoetik hücreleri ayırt etmek için embriyoid cisim (EB) oluşumu kullanılmıştır, ancak tek tabaka tabanlı yaklaşımlar, EB indüksiyonu gerektirmeyen başka bir hematopoietik farklılaşma stratejisini temsil eder. Bununla birlikte, tek katmanlı tabanlı sistemler daha fazla optimizasyon gerektiriyor gibi görünmektedir, çünkü biz ve diğerleri, EB tabanlı yaklaşımların OC’lerin farklılaşması için daha sağlam olduğunu gördük.
Burada, EB tabanlı bir protokol kullanarak OC’lerin insan iPSC’lerinden farkını açıklıyoruz. Bu protokol Rössler ve ark.26’dan uyarlanmış ve farklılaşma işlemi sırasında sağlamlığı artırmak ve kriyoprezervasyona izin vermek için modifiye edilmiştir. İlk olarak, hematopoietik hücreleri 10 günlük farklılaşmadan sonra sadece bir kez topladık. Hematopoetik hücreler daha sonra farklılaşma işlemi sırasında daha fazla esneklik sağlamak için dondurularak saklandı. Ek olarak, OK farklılaşması için hematopoetik hücre tohumlama yoğunluğunu 1 x 105’ten 2 x 105 hücre/cm2’ye çıkardık. Daha yeni bir insan iPSC serumsuz ortam (hiPSC-SFM, Malzeme Tablosuna bakınız) kullanıldı ve kuyucukların kaplanması% 0.1 jelatin yerine 200-300 μg / mL bazal membran ekstraktı (Malzeme Tablosuna bakınız) ile gerçekleştirildi. Penisilin / streptomisin medyaya eklenmedi.
Rössler ve ark.26 tarafından yapılan protokol orijinal olarak bir iPSC’den hematopoietik farklılaşma için EB oluşumunu kullanan bir makrofaj farklılaşma protokolü28’e uyarlanmıştır. EB oluşumu araştırmacılar tarafından hematopoetik farklılaşma için uzun süredir kullanılmaktadır29,30, literatürde spontan agregasyon, yuvarlak tabanlı bir kuyu plakasında santrifüjleme, asılı damla kültürü, biyoreaktör kültürü, konik tüp kültürü, yavaş dönen lateral damar ve mikro kalıp jel kültürü gibi çeşitli EB indüksiyon yöntemleri tanımlanmıştır31. Bu protokol, aşağıda açıklandığı gibi, tek iPSC hücrelerini birbirine yaklaştırmak ve küre (EB) oluşumuna izin vermek için ayrışmış iPSC’lerin yuvarlak tabanlı bir kuyu plakasında santrifüjlenmesini kullanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, iPSC’leri OC’lere ayırmak için güvenilir ve sağlam bir yöntem sunar. Bununla birlikte, farklılaşma süreci boyunca karşılaşılabilecek çeşitli tuzaklar vardır. Farklı doku kökenli hücrelerden üretilen insan iPSC hatları, bu protokol kullanılarak başarılı bir şekilde farklılaştırılmıştır33. iPSC’leri dondururken (bkz. protokol adımı “3. iPSC’lerin dondurulması”), geçiş noktasındaki bir kuyu tekrar bir kriyoviyal olarak donduruldu. Çözdürürken (bk…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, teknik yardım ve destekleri için Giachelli laboratuvarı üyelerine teşekkür eder. W. M. Keck Mikroskopi Merkezi’ne ve Keck Merkezi yöneticisi Dr. Nathanial Peters’a konfokal mikroskopi ve geniş alan mikroskobu görüntülerinin elde edilmesindeki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca teknik destek ve yardım için UW Akış Çekirdeği Tesisi ve Akış Çekirdeği Tesisi yöneticisi Aurelio Silvestroni’ye teşekkür ederiz. Son olarak, illüstrasyon ve grafik tasarım konusundaki desteği için Hannah Blümke’ye teşekkür ederiz.
Finansman, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R35 HL139602-01 aracılığıyla sağlandı. Ayrıca, WM Keck Center’daki enstrüman finansmanı için NIH S10 hibesi S10 OD016240’ı ve UW Flow Core Facility’deki enstrüman finansmanı için NIH hibesi 1S10OD024979-01A1’i de kabul ediyoruz.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-10ML | |
| Antibody – Anti-Cathepsin K | Abcam | ab19027 | |
| Antibody – APC-conjugated Anti-Human CD45 | BD | 555485 | |
| Antibody – APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | |
| Antibody – BV711-conjugated Anti-Human CD14 | BD | 563372 | |
| Antibody – BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD | 563125 | |
| Antibody – Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647 | Abcam | ab150079 | |
| Antibody – PE-conjugated Anti-Human CD14 | R&D Systems | FAB3832P-025 | |
| Antibody – PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b | R&D Systems | FAB16991P-025 | |
| Antibody – PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34 | BD | 560710 | |
| Antibody – PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557872 | |
| Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b | Biolegend | 301308 | |
| Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl | Biolegend | 400118 | |
| Antibody – PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 550795 | |
| Antibody – PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43 | BD | 563521 | |
| Bone Resorption Assay Kit | CosmoBioUSA | CSR-BRA-24KIT | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher | 16812556 | |
| Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Sytems | 3434-010-02 | Basal membrane extract |
| DAPI | R&D Systems | 5748/10 | |
| Dispase (5 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Stem Cell | 36254 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537-500ML | |
| Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4) | STEMCELL Technologies | 78211 | |
| Human IL-3 | STEMCELL Technologies | 78146.1 | |
| Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF) | STEMCELL Technologies | 78150.1 | |
| Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL) | STEMCELL Technologies | 78214.1 | |
| Human Stem Cell Factor (hSCF) | STEMCELL Technologies | 78155.1 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | Biolegend | 422301 | |
| Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165) | STEMCELL Technologies | 78073 | |
| Invitrogen Rhodamine Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| MEM α, nucleosides, no phenol red | ThermoFisher | 41061029 | |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 05855 | Serum free cryopreservation medium |
| mTeSR Plus medium | STEMCELL Technologies | 100-0276 | Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM) |
| Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 174925 | Round bottom ultra-low attachment 96-well plate |
| P1000 Wide Bore Tips | ThermoFisher | 2079GPK | |
| ROCK-Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| StemSpan SFEM | StemCell | 09650 | Hematopoietic cell culture medium |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher | 12563011 | Single-cell dissociation reagent |
| Ultraglutamine | Bioscience Lonza | BE17-605E/U1 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Bioscience Lonza | 04-418Q | Hematopoietic basal medium |
| µ-Slide 8 Well High | Ibidi | 80806 |
Riferimenti
- Bar-Shavit, Z. The osteoclast: A multinucleated, hematopoietic-origin, bone-resorbing osteoimmune cell. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (5), 1130-1139 (2007).
- Boyce, B. F. Advances in the regulation of osteoclasts and osteoclast functions. Journal of Dental Research. 92 (10), 860-867 (2013).
- Buranaphatthana, W., et al. Engineered osteoclasts resorb necrotic alveolar bone in anti-RANKL antibody-treated mice. Bone. 153, 116144 (2021).
- Wang, L., et al. Isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (147), e58895 (2019).
- Mercatali, L., et al. Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Marino, S., Bishop, R. T., de Ridder, D., Delgado-Calle, J., Reagan, M. R. 2D and 3D in vitro co-culture for cancer and bone cell interaction studies. Methods in Molecular Biology. 1914, 71-98 (2019).
- Rementer, C. W., et al. An inducible, ligand-independent receptor activator of NF-κB gene to control osteoclast differentiation from monocytic precursors. PloS One. 8 (12), e0084465 (2013).
- Rementer, C., et al. Engineered myeloid precursors differentiate into osteoclasts and resorb heterotopic ossification in mice. Research Square Priprint. , 2156913 (2022).
- Bjelić, D., Finšgar, M. Bioactive coatings with anti-osteoclast therapeutic agents for bone implants: Enhanced compliance and prolonged implant life. Pharmacological Research. 176, 106060 (2022).
- Minkin, C., Marinho, V. C. Role of the osteoclast at the bone-implant interface. Advances in dental research. 13, 49-56 (1999).
- Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: Review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 1-35 (2020).
- Mun, S. H., Park, P. S. U., Park-Min, K. H. The M-CSF receptor in osteoclasts and beyond. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1239-1254 (2020).
- Plotkin, L. I., Bivi, N. Local regulation of bone cell function. Basic and Applied Bone Biology. , 47-73 (2014).
- Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
- Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
- Boyce, B. F., Xiu, Y., Li, J., Xing, L., Yao, Z. NF-κB-mediated regulation of osteoclastogenesis. Endocrinology and Metabolism. 30 (1), 35 (2015).
- Novack, D. V. Role of NF-κB in the skeleton. Cell Research. 21 (1), 169-182 (2010).
- Kim, K., Lee, S. H., Jung, H. K., Choi, Y., Kim, N. NFATc1 induces osteoclast fusion via up-regulation of Atp6v0d2 and the dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP). Molecular Endocrinology. 22 (1), 176-185 (2008).
- Wu, H., Xu, G., Li, Y. P. Atp6v0d2 is an essential component of the osteoclast-specific proton pump that mediates extracellular acidification in bone resorption. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (5), 871 (2009).
- Vignery, A. Macrophage fusion: The making of osteoclasts and giant cells. The Journal of Experimental Medicine. 202 (3), 337 (2005).
- Chiu, Y. H., Ritchlin, C. T. DC-STAMP: A key regulator in osteoclast differentiation. Journal of Cellular Physiology. 231 (11), 2402 (2016).
- Riedlova, P., Sood, S., Goodyear, C. S., Ansalone, C. Differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood CD14+ monocytes. Journal of Visualized Experiments. (191), e64698 (2023).
- Gothot, A., Pyatt, R., McMahel, J., Rice, S., Srour, E. F. Functional heterogeneity of human CD34+ cells isolated in subcompartments of the G0 /G1 phase of the cell cycle. Blood. 90 (11), 4384-4393 (1997).
- Dinella, J., Koster, M. I., Koch, P. J. Use of induced pluripotent stem cells in dermatological research. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (8), e23 (2014).
- Grigoriadis, A. E., et al. Directed differentiation of hematopoietic precursors and functional osteoclasts from human ES and iPS cells. Blood. 115 (14), 2769-2776 (2010).
- Rössler, U., et al. Efficient generation of osteoclasts from human induced pluripotent stem cells and functional investigations of lethal CLCN7-related osteopetrosis. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 36 (8), 1621-1635 (2021).
- Chen, I. -. P. Differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into osteoclasts. Bio-Protocol. 10 (24), e3854-e3854 (2020).
- Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
- Abe, K., et al. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Experimental Cell Research. 229 (1), 27-34 (1996).
- Perlingeiro, R. C. R., Kyba, M., Daley, G. Q. Clonal analysis of differentiating embryonic stem cells reveals a hematopoietic progenitor with primitive erythroid and adult lymphoid-myeloid potential. Development. 128 (22), 4597-4604 (2001).
- Pettinato, G., Wen, X., Zhang, N. Engineering strategies for the formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 24 (14), 1595 (2015).
- Ruiz, J. P., et al. Robust generation of erythroid and multilineage hematopoietic progenitors from human iPSCs using a scalable monolayer culture system. Stem Cell Research. 41, 101600 (2019).
- Blümke, A., et al. Comparison of osteoclast differentiation protocols from human induced pluripotent stem cells of different tissue origins. Stem Cell Research & Therapy. 14 (1), 319 (2023).
- Klepikova, A., et al. iPSC-Derived Macrophages: The differentiation protocol affects cell immune characteristics and differentiation trajectories. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 16087 (2022).
- Neely, M. D., Tidball, A. M., Aboud, A. A., Ess, K. C., Bowman, A. B. Induced pluripotent stem cells (iPSCs): An emerging model system for the study of human neurotoxicology. Neuromethods. 56, 27-61 (2011).
- Doulatov, S., et al. Induction of multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via re-specification of lineage-restricted precursors. Cell Stem Cell. 13 (4), 459-470 (2013).
- Van Winkle, A. P., Gates, I. D., Kallos, M. S. Mass transfer limitations in embryoid bodies during human embryonic stem cell differentiation. Cells, Tissues, Organs. 196 (1), 34-47 (2012).
- Kim, J. M., et al. Assessment of differentiation aspects by the morphological classification of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 20 (11), 1925-1935 (2011).
- Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (158), e61038 (2020).
- Cao, X., et al. Differentiation and functional comparison of monocytes and macrophages from hiPSCs with peripheral blood derivatives. Stem Cell Reports. 12 (6), 1282 (2019).
- Omata, Y., et al. Interspecies single-cell RNA-seq analysis reveals the novel trajectory of osteoclast differentiation and therapeutic targets. JBMR Plus. 6 (7), e10631 (2022).
- Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
- Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201 (2002).
- Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in psteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 641162 (2021).
- Bernhardt, A., Schamel, M., Gbureck, U., Gelinsky, M. Osteoclastic differentiation and resorption is modulated by bioactive metal ions Co2+, Cu2+ and Cr3+ incorporated into calcium phosphate bone cements. PLoS One. 12 (8), e0182109 (2017).
- Akasaka, T., et al. Different micro/nano-scale patterns of surface materials influence osteoclastogenesis and actin structure. Nano Research. 15 (5), 4201-4211 (2022).
- Hobolt-Pedersen, A. S., Delaissé, J. M., Søe, K. Osteoclast fusion is based on heterogeneity between fusion partners. Calcified Tissue International. 95 (1), 73 (2014).
