Differensiering og karakterisering av osteoklaster fra humane induserte pluripotente stamceller
Summary
Denne protokollen presenterer differensiering av humane osteoklaster fra induserte pluripotente stamceller (iPSCs) og beskriver metoder for karakterisering av osteoklaster og osteoklastforløpere.
Abstract
Denne protokollen beskriver forplantning og passering av humane iPSCs og deres differensiering i osteoklaster. Først dissosieres iPSCs til en encellesuspensjon for videre bruk i embryoid kroppsinduksjon. Etter mesodermal induksjon gjennomgår embryoidlegemer hematopoietisk differensiering, og produserer en flytende hematopoietisk cellepopulasjon. Deretter gjennomgår de høstede hematopoietiske cellene et makrofagkolonistimulerende faktormodningstrinn og til slutt osteoklastdifferensiering. Etter osteoklastdifferensiering karakteriseres osteoklaster ved farging for TRAP i forbindelse med en metylgrønn nukleær flekk. Osteoklaster observeres som multinukleerte, TRAP+ polykaryoner. Deres identifikasjon kan støttes ytterligere av Cathepsin K-farging. Ben- og mineralresorpsjonsanalyser tillater funksjonell karakterisering, og bekrefter identiteten til bona fide osteoklaster. Denne protokollen demonstrerer en robust og allsidig metode for å skille humane osteoklaster fra iPSCer og muliggjør enkel adopsjon i applikasjoner som krever store mengder funksjonelle humane osteoklaster. Søknader innen beinforskning, kreftforskning, vevsteknikk og endoproteseforskning kan tenkes.
Introduction
Osteoklaster (OC) er hematopoietisk-avledede 1,2, allsidige celletyper som ofte brukes av forskere på områder som forskning på beinsykdom 3,4, kreftforskning 5,6, vevsteknikk 7,8 og endoproteseforskning 9,10. Likevel kan OC-differensiering være utfordrende, da fusjon av mononukleære forløpere til multinukleære OC-er er nødvendig for å skape funksjonelle OC-er11. Flere biologiske faktorer, som reseptoraktivator av NF-κB-ligand (RANKL) og makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF), er nødvendige for OC-differensiering. M-CSF har blitt rapportert å ha en positiv effekt på celleproliferasjon, celleoverlevelse og RANK-uttrykk 12,13,14. På den annen side binder RANKL seg til RANK, som aktiverer nedstrøms signalkaskader som induserer osteoklastogenese. Aktivering medieres via TNF-reseptorassosiert faktor 6 (TRAF6), noe som fører til nedbrytning av nukleær faktor av kappa lett polypeptidgenforsterker i B-cellehemmer, alfa (IκB-α), et bindende protein som binder NF-kB-dimerer16,17. Derfor frigjør IκB-α-nedbrytning NF-kB-dimerer, som deretter translokerer inn i kjernen og induserer ekspresjonen av transkripsjonsfaktorene c-Fos og nukleær faktor av aktiverte T-celler 1 (NFATc1). Dette utløser i sin tur transkripsjonen av en rekke OC-differensieringsrelaterte proteiner15,18. Oppregulerte proteiner som DC-Stamp og Atp6v0d2 medierer cellecellefusjon av OC-forløpere, noe som fører til syncytiumdannelse 19,20,21.
Når det gjelder humane primærceller, er CD34+ og CD14+ PBMC for tiden de mest brukte celletypene for differensiering til OC22. Denne tilnærmingen er imidlertid begrenset av heterogeniteten i CD34+ -populasjonen av høstede celler fra donorer23 og deres begrensede utvidbarhet. Humane iPSCer presenterer en alternativ kilde for OSC-er. Siden de kan forplantes på ubestemt tid24, gir de mulighet for utvidelse og oppskalering av OC-produksjon. Dette muliggjør differensiering av et stort antall OC-er, noe som letter OC-forskning.
Flere protokoller for differensiering av iPSCs i OCs har blitt publisert 25,26,27. Hele differensieringsprosessen kan deles inn i en iPSC-forplantningsdel, en mesodermal og hematopoietisk differensieringsdel og OC-differensiering. Forplantning av iPSCer før differensieringsprosessen muliggjør oppskalering av OC-produksjon før differensiering. Det finnes flere tilnærminger til mesodermal og hematopoietisk differensiering. Tradisjonelt har embryoid legemedannelse (EB) blitt brukt til å differensiere hematopoietiske celler, men monolagsbaserte tilnærminger representerer en annen hematopoietisk differensieringsstrategi som ikke krever EB-induksjon. Likevel synes monolayer-baserte systemer å kreve ytterligere optimalisering, da vi og andre har funnet at EB-baserte tilnærminger er mer robuste for differensiering av OC.
Her beskriver vi differensieringen av OC-er fra humane iPSCer ved hjelp av en EB-basert protokoll. Denne protokollen ble tilpasset fra Rössler et al.26 og modifisert for å øke robustheten og tillate kryopreservering under differensieringsprosessen. Først høstet vi hematopoietiske celler bare en gang etter 10 dager med differensiering. Hematopoietiske celler ble deretter kryopreservert for å tillate mer fleksibilitet under differensieringsprosessen. I tillegg økte vi den hematopoietiske cellesåtettheten fra 1 x 105 til 2 x 105 celler / cm2 for OC-differensiering. Et nyere humant iPSC serumfritt medium (hiPSC-SFM, se materialtabell) ble brukt, og belegging av brønner ble utført med 200-300 μg/ml basalmembranekstrakt (se materialtabell) i stedet for 0,1 % gelatin. Penicillin/streptomycin ble ikke tilsatt media.
Protokollen av Rössler et al.26 ble opprinnelig tilpasset fra en iPSC til en makrofagdifferensieringsprotokoll28 som bruker EB-dannelse for hematopoietisk differensiering. Mens EB-dannelse har blitt brukt i lengre tid av forskere for hematopoietisk differensiering29,30, har flere metoder for EB-induksjon blitt beskrevet i litteraturen, for eksempel spontan aggregering, sentrifugering i en rundbunnsbrønnplate, hengende dråpekultur, bioreaktorkultur, konisk rørkultur, langsomt svingende lateralt kar og mikromoldgelkultur31. Denne protokollen bruker sentrifugering av dissosierte iPSCer i en rundbunns brønnplate for å bringe enkle iPSC-celler i nærheten av hverandre og for å tillate kuledannelse (EB), som beskrevet nedenfor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen tilbyr en pålitelig og robust metode for å skille iPSCer i OCC-er. Likevel er det flere fallgruver som kan oppstå gjennom differensieringsprosessen. Humane iPSC-linjer generert fra celler med forskjellig vevsopprinnelse har blitt differensiert ved hjelp av denne protokollen33. Ved frysing av iPSCs (se protokolltrinn “3. Fryser tilbake iPSCs”), ble en brønn på passasjepunktet frosset tilbake til en cryovial. Ved tining (se protokolltrinn “1. Tining og forplantning av humane i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke medlemmene av Giachelli lab for deres tekniske hjelp og støtte. Vi takker WM Keck Microscopy Center og Keck Center manager, Dr. Nathanial Peters, for hjelp til å skaffe konfokal mikroskopi og widefield mikroskopi bilder. Vi takker også UW Flow Core Facility og lederen for Flow Core Facility, Aurelio Silvestroni, for teknisk støtte og assistanse. Til slutt takker vi Hannah Blümke for støtten med illustrasjon og grafisk design.
Finansiering ble gitt gjennom National Institutes of Health grant R35 HL139602-01. Vi anerkjenner også NIH S10 tilskudd S10 OD016240 for instrumentfinansiering ved WM Keck Center samt NIH tilskudd 1S10OD024979-01A1 for instrumentfinansiering ved UW Flow Core Facility.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-10ML | |
| Antibody – Anti-Cathepsin K | Abcam | ab19027 | |
| Antibody – APC-conjugated Anti-Human CD45 | BD | 555485 | |
| Antibody – APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | |
| Antibody – BV711-conjugated Anti-Human CD14 | BD | 563372 | |
| Antibody – BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD | 563125 | |
| Antibody – Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647 | Abcam | ab150079 | |
| Antibody – PE-conjugated Anti-Human CD14 | R&D Systems | FAB3832P-025 | |
| Antibody – PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b | R&D Systems | FAB16991P-025 | |
| Antibody – PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34 | BD | 560710 | |
| Antibody – PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557872 | |
| Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b | Biolegend | 301308 | |
| Antibody – PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl | Biolegend | 400118 | |
| Antibody – PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 550795 | |
| Antibody – PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43 | BD | 563521 | |
| Bone Resorption Assay Kit | CosmoBioUSA | CSR-BRA-24KIT | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher | 16812556 | |
| Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Sytems | 3434-010-02 | Basal membrane extract |
| DAPI | R&D Systems | 5748/10 | |
| Dispase (5 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Stem Cell | 36254 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537-500ML | |
| Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4) | STEMCELL Technologies | 78211 | |
| Human IL-3 | STEMCELL Technologies | 78146.1 | |
| Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF) | STEMCELL Technologies | 78150.1 | |
| Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL) | STEMCELL Technologies | 78214.1 | |
| Human Stem Cell Factor (hSCF) | STEMCELL Technologies | 78155.1 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | Biolegend | 422301 | |
| Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165) | STEMCELL Technologies | 78073 | |
| Invitrogen Rhodamine Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| MEM α, nucleosides, no phenol red | ThermoFisher | 41061029 | |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 05855 | Serum free cryopreservation medium |
| mTeSR Plus medium | STEMCELL Technologies | 100-0276 | Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM) |
| Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 174925 | Round bottom ultra-low attachment 96-well plate |
| P1000 Wide Bore Tips | ThermoFisher | 2079GPK | |
| ROCK-Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| StemSpan SFEM | StemCell | 09650 | Hematopoietic cell culture medium |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher | 12563011 | Single-cell dissociation reagent |
| Ultraglutamine | Bioscience Lonza | BE17-605E/U1 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Bioscience Lonza | 04-418Q | Hematopoietic basal medium |
| µ-Slide 8 Well High | Ibidi | 80806 |
Riferimenti
- Bar-Shavit, Z. The osteoclast: A multinucleated, hematopoietic-origin, bone-resorbing osteoimmune cell. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (5), 1130-1139 (2007).
- Boyce, B. F. Advances in the regulation of osteoclasts and osteoclast functions. Journal of Dental Research. 92 (10), 860-867 (2013).
- Buranaphatthana, W., et al. Engineered osteoclasts resorb necrotic alveolar bone in anti-RANKL antibody-treated mice. Bone. 153, 116144 (2021).
- Wang, L., et al. Isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (147), e58895 (2019).
- Mercatali, L., et al. Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Marino, S., Bishop, R. T., de Ridder, D., Delgado-Calle, J., Reagan, M. R. 2D and 3D in vitro co-culture for cancer and bone cell interaction studies. Methods in Molecular Biology. 1914, 71-98 (2019).
- Rementer, C. W., et al. An inducible, ligand-independent receptor activator of NF-κB gene to control osteoclast differentiation from monocytic precursors. PloS One. 8 (12), e0084465 (2013).
- Rementer, C., et al. Engineered myeloid precursors differentiate into osteoclasts and resorb heterotopic ossification in mice. Research Square Priprint. , 2156913 (2022).
- Bjelić, D., Finšgar, M. Bioactive coatings with anti-osteoclast therapeutic agents for bone implants: Enhanced compliance and prolonged implant life. Pharmacological Research. 176, 106060 (2022).
- Minkin, C., Marinho, V. C. Role of the osteoclast at the bone-implant interface. Advances in dental research. 13, 49-56 (1999).
- Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: Review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 1-35 (2020).
- Mun, S. H., Park, P. S. U., Park-Min, K. H. The M-CSF receptor in osteoclasts and beyond. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1239-1254 (2020).
- Plotkin, L. I., Bivi, N. Local regulation of bone cell function. Basic and Applied Bone Biology. , 47-73 (2014).
- Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
- Ono, T., Nakashima, T. Recent advances in osteoclast biology. Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).
- Boyce, B. F., Xiu, Y., Li, J., Xing, L., Yao, Z. NF-κB-mediated regulation of osteoclastogenesis. Endocrinology and Metabolism. 30 (1), 35 (2015).
- Novack, D. V. Role of NF-κB in the skeleton. Cell Research. 21 (1), 169-182 (2010).
- Kim, K., Lee, S. H., Jung, H. K., Choi, Y., Kim, N. NFATc1 induces osteoclast fusion via up-regulation of Atp6v0d2 and the dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP). Molecular Endocrinology. 22 (1), 176-185 (2008).
- Wu, H., Xu, G., Li, Y. P. Atp6v0d2 is an essential component of the osteoclast-specific proton pump that mediates extracellular acidification in bone resorption. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (5), 871 (2009).
- Vignery, A. Macrophage fusion: The making of osteoclasts and giant cells. The Journal of Experimental Medicine. 202 (3), 337 (2005).
- Chiu, Y. H., Ritchlin, C. T. DC-STAMP: A key regulator in osteoclast differentiation. Journal of Cellular Physiology. 231 (11), 2402 (2016).
- Riedlova, P., Sood, S., Goodyear, C. S., Ansalone, C. Differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood CD14+ monocytes. Journal of Visualized Experiments. (191), e64698 (2023).
- Gothot, A., Pyatt, R., McMahel, J., Rice, S., Srour, E. F. Functional heterogeneity of human CD34+ cells isolated in subcompartments of the G0 /G1 phase of the cell cycle. Blood. 90 (11), 4384-4393 (1997).
- Dinella, J., Koster, M. I., Koch, P. J. Use of induced pluripotent stem cells in dermatological research. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (8), e23 (2014).
- Grigoriadis, A. E., et al. Directed differentiation of hematopoietic precursors and functional osteoclasts from human ES and iPS cells. Blood. 115 (14), 2769-2776 (2010).
- Rössler, U., et al. Efficient generation of osteoclasts from human induced pluripotent stem cells and functional investigations of lethal CLCN7-related osteopetrosis. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 36 (8), 1621-1635 (2021).
- Chen, I. -. P. Differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into osteoclasts. Bio-Protocol. 10 (24), e3854-e3854 (2020).
- Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
- Abe, K., et al. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Experimental Cell Research. 229 (1), 27-34 (1996).
- Perlingeiro, R. C. R., Kyba, M., Daley, G. Q. Clonal analysis of differentiating embryonic stem cells reveals a hematopoietic progenitor with primitive erythroid and adult lymphoid-myeloid potential. Development. 128 (22), 4597-4604 (2001).
- Pettinato, G., Wen, X., Zhang, N. Engineering strategies for the formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 24 (14), 1595 (2015).
- Ruiz, J. P., et al. Robust generation of erythroid and multilineage hematopoietic progenitors from human iPSCs using a scalable monolayer culture system. Stem Cell Research. 41, 101600 (2019).
- Blümke, A., et al. Comparison of osteoclast differentiation protocols from human induced pluripotent stem cells of different tissue origins. Stem Cell Research & Therapy. 14 (1), 319 (2023).
- Klepikova, A., et al. iPSC-Derived Macrophages: The differentiation protocol affects cell immune characteristics and differentiation trajectories. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 16087 (2022).
- Neely, M. D., Tidball, A. M., Aboud, A. A., Ess, K. C., Bowman, A. B. Induced pluripotent stem cells (iPSCs): An emerging model system for the study of human neurotoxicology. Neuromethods. 56, 27-61 (2011).
- Doulatov, S., et al. Induction of multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via re-specification of lineage-restricted precursors. Cell Stem Cell. 13 (4), 459-470 (2013).
- Van Winkle, A. P., Gates, I. D., Kallos, M. S. Mass transfer limitations in embryoid bodies during human embryonic stem cell differentiation. Cells, Tissues, Organs. 196 (1), 34-47 (2012).
- Kim, J. M., et al. Assessment of differentiation aspects by the morphological classification of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 20 (11), 1925-1935 (2011).
- Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (158), e61038 (2020).
- Cao, X., et al. Differentiation and functional comparison of monocytes and macrophages from hiPSCs with peripheral blood derivatives. Stem Cell Reports. 12 (6), 1282 (2019).
- Omata, Y., et al. Interspecies single-cell RNA-seq analysis reveals the novel trajectory of osteoclast differentiation and therapeutic targets. JBMR Plus. 6 (7), e10631 (2022).
- Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
- Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201 (2002).
- Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in psteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 641162 (2021).
- Bernhardt, A., Schamel, M., Gbureck, U., Gelinsky, M. Osteoclastic differentiation and resorption is modulated by bioactive metal ions Co2+, Cu2+ and Cr3+ incorporated into calcium phosphate bone cements. PLoS One. 12 (8), e0182109 (2017).
- Akasaka, T., et al. Different micro/nano-scale patterns of surface materials influence osteoclastogenesis and actin structure. Nano Research. 15 (5), 4201-4211 (2022).
- Hobolt-Pedersen, A. S., Delaissé, J. M., Søe, K. Osteoclast fusion is based on heterogeneity between fusion partners. Calcified Tissue International. 95 (1), 73 (2014).
