测量 HIV-1 感染的 T 细胞中的内质网应激和未折叠蛋白反应并分析其在 HIV-1 复制中的作用

获得性免疫缺陷综合症 （AIDS） 的特征是 CD4⁺ T 淋巴细胞数量逐渐减少，导致免疫反应进行性衰竭。人类免疫缺陷病毒 1 （HIV-1） 是艾滋病的病原体。它是一种有包膜的正义单链 RNA 病毒，每个病毒体有两个 RNA 拷贝，属于逆转录病毒科。宿主细胞内高浓度病毒蛋白的产生会给细胞的蛋白质折叠机制带来过大的压力¹。ER 是真核细胞分泌途径中的第一个隔室。它负责产生、改变和递送蛋白质到分泌途径和细胞外空间靶位点。蛋白质在内质网中经历许多翻译后变化并折叠成其自然构象，包括天冬酰胺连接的糖基化以及分子内和分子间二硫键的产生²。因此，内质网腔中存在高浓度的蛋白质，这些蛋白质很容易聚集和错误折叠。各种生理状况，如热休克、微生物或病毒感染，需要增强蛋白质合成或蛋白质突变，由于内质网中蛋白质积累增加，导致内质网应激，从而扰乱内质网管腔稳态。ER 应激激活了一个高度保守的适应性信号转导通路网络，即未折叠蛋白反应 （UPR）³。UPR 用于通过调整其未折叠的蛋白质负荷和折叠能力来恢复正常的 ER 生理状况。这是通过增加 ER 大小和 ER 驻留分子伴侣和折叠酶来实现的，从而导致 ER 折叠能力的提高。UPR 还通过在翻译水平的整体蛋白质合成衰减来降低 ER 的蛋白质载量，并通过上调 ER 相关降解 （ERAD） 来增加未折叠蛋白质从 ER 中的清除率^4,5。

ER 应激由三种驻留在 ER 上的跨膜蛋白感知：蛋白激酶 R （PKR） 样内质网激酶 （PERK）、激活转录因子 6 （ATF6） 和肌醇需求酶 1 型 （IRE1）。所有这些效应子都通过与伴侣热休克蛋白家族 A （Hsp70） 成员 5 （HSPA5） 结合而保持失活，也称为结合蛋白 （BiP）/78-kDa 葡萄糖调节蛋白 （GRP78）。在 ER 应激和未折叠/错误折叠蛋白积累时，HSPA5 解离并导致这些效应子激活，然后激活一系列下游靶标，这些靶标有助于解决 ER 应激，并在极端条件下促进细胞死亡⁶。与 HSPA5 解离后，PERK 自磷酸化，其激酶活性被激活⁷。其激酶活性磷酸化 eIF2α，导致翻译衰减，从而降低 ER 的蛋白载量⁸。然而，在磷酸化真核起始因子 2α （eIF2α） 存在的情况下，特定 mRNA 上的非翻译开放阅读框（如 ATF4）会优先翻译，从而调节应激诱导的基因。ATF4 和 C/EBP 同源蛋白 （CHOP） 是调节应激诱导基因并调节细胞凋亡和细胞死亡通路的转录因子 ^9,10。ATF4 和 CHOP 的靶标之一是生长停滞和 DNA 损伤诱导蛋白 （GADD34），它与蛋白磷酸酶 1 一起使 peIF2α 去磷酸化，并充当翻译衰减的反馈调节因子¹¹。在 ER 应激下，ATF6 与 HSPA5 解离，其高尔基体定位信号暴露，导致其易位到高尔基体。在高尔基体中，ATF6 被 1 位点蛋白酶 （S1P） 和 2 位点蛋白酶 （S2P） 切割，以释放 ATF6 （ATF6 P50） 的切割形式。然后，ATF6 p50 易位到细胞核，在那里它诱导参与蛋白质折叠、成熟和分泌以及蛋白质降解的基因的表达^12,13。在 ER 应激期间，IRE1 与 HSPA5 解离、多聚化和自磷酸化¹⁴。IRE1 的磷酸化会激活其 RNase 结构域，特异性介导 X-box 结合蛋白 1 （XBP1） mRNA 中心部分的 26 个核苷酸剪接^15,16。这会产生一个新的 C 端，赋予反式激活功能，产生功能性 XBP1s 蛋白，这是一种有效的转录因子，控制多个 ER 应激诱导的基因^17,18。这些转录因子的联合活性会开启旨在恢复 ER 稳态的遗传程序。

有多种方法可以检测 ER 压力和 UPR。这些方法包括分析 UPR 标志物的常规方法 ^19,20。各种非常规方法包括测量 UPR 的氧化还原状态和 ER 腔中的钙分布以及评估 ER 结构。电子显微镜可用于观察细胞和组织中 ER 管腔因 ER 应激而增大的程度。然而，这种方法很耗时，并且取决于电子显微镜的可用性，而电子显微镜可能并非每个研究小组都可用。此外，由于试剂的可用性，测量 ER 的钙通量和氧化还原状态也具有挑战性。此外，这些实验的读数非常敏感，可能会受到细胞代谢其他因素的影响。

监测 UPR 输出的一种强大而简单的技术是测量 UPR 不同信号通路的激活，并且已经在各种压力场景中使用了几十年。这些测量 UPR 激活的常规方法经济、可行，并且与其他已知方法相比，可以在更短的时间内提供信息。这些包括免疫印迹，用于测量蛋白质水平上 UPR 标志物的表达，例如 IRE1、PERK 和 eIF2α 的磷酸化以及 ATF6 的切割，通过测量 ATF6 的 P50 形式和其他标志物（如 HSPA5、剪接 XBP1、ATF4、CHOP 和 GADD34）的蛋白表达，以及 RT-PCR，以确定 mRNA 水平以及 XBP1 mRNA 的剪接。

本文介绍了一套经过验证的可靠方案，用于监测 HIV-1 感染细胞中的 ER 应激和 UPR 激活，并确定 UPR 在 HIV-1 复制和感染性中的功能相关性。这些方案使用易得且经济的试剂，并提供有关 UPR 输出的令人信服的信息。ER 应激是未折叠/错误折叠蛋白质积累的结果，这些蛋白质容易形成蛋白质聚集体²¹。我们特此描述了一种在 HIV-1 感染的细胞中检测这些蛋白质聚集体的方法。硫黄素 T 染色是一种相对较新的方法，用于检测和定量这些蛋白质聚集体²²。Beriault 和 Werstuck 描述了这种技术来检测和量化活细胞中的蛋白质聚集体，从而检测和量化 ER 应激水平。已经证明，小荧光分子硫黄素 T （ThT） 选择性地与蛋白质聚集体结合，尤其是淀粉样蛋白原纤维。

在本文中，我们描述了使用 ThT 检测和量化 HIV-1 感染细胞中的 ER 应激，并通过测量 UPR 不同信号通路的激活，将其与监测 UPR 的常规方法相关联。

由于也缺乏关于 UPR 在 HIV-1 感染过程中的作用的全面信息，因此我们提供了一套方案来了解 UPR 在 HIV-1 复制和病毒粒子感染性中的作用。这些方案包括慢病毒介导的 UPR 标志物敲低以及用药理学 ER 应激诱导剂治疗。本文还介绍了可用于测量 HIV-1 基因表达、病毒产生以及产生的病毒粒子的感染性的读出类型，例如基于长末端重复序列 （LTR） 的荧光素酶测定、p24 酶联免疫吸附测定 （ELISA） 和 β-gal 报告基因染色测定。

使用其中的大部分方案，我们最近报道了 HIV-1 感染对 T 细胞²³ 中 UPR 的功能影响，该文章的结果表明此处描述的方法的可靠性。因此，本文提供了一组关于 HIV-1 与 ER 应激和 UPR 激活相互作用的综合信息方法。