Validação preliminar de coordenadas de injeção estereotáxica via crioseccionamento
Summary
O presente protocolo descreve uma estratégia prática para agilizar a etapa de verificação das coordenadas de injeção estereotáxica antes de realizar o rastreamento viral usando corantes e seções congeladas.
Abstract
A injeção estereotáxica de uma região específica do cérebro constitui uma técnica experimental fundamental na neurociência básica. Os pesquisadores geralmente baseiam sua escolha de parâmetros de injeção estereotáxica em atlas cerebrais de camundongos ou materiais publicados que empregaram várias populações/idades de camundongos e diferentes equipamentos estereotáxicos, necessitando de validação adicional dos parâmetros de coordenadas estereotáxicas. A eficácia das manipulações de imagens de cálcio, quimiogenéticas e optogenéticas depende da expressão precisa de genes repórteres dentro da região de interesse, muitas vezes exigindo várias semanas de esforço. Assim, é uma tarefa demorada se as coordenadas da região alvo do cérebro não forem verificadas com antecedência. Usando um corante apropriado em vez de um vírus e implementando a criossecção, os pesquisadores podem observar o local da injeção imediatamente após a administração do corante. Isso facilita ajustes oportunos para coordenar os parâmetros nos casos em que existem discrepâncias entre o local real da injeção e a posição teórica. Tais ajustes aumentam significativamente a precisão da expressão viral dentro da região-alvo em experimentos subsequentes.
Introduction
Quase todas as ferramentas modernas de neuromodulação, incluindo registro de cálcio in vivo, ferramentas optogenéticas e quimiogenéticas, requerem o uso de coordenadas estereotáxicas para atingir a área de interesse do cérebro 1,2,3, formando a base da manipulação neural. As coordenadas estereotáxicas para as regiões do cérebro de camundongos são definidas em relação ao bregma e lambda, os marcos ósseos no crânio, formando o chamado sistema de coordenadas estereotáxicas derivado do crânio. Bregma ou lambda podem servir como o ponto zero das coordenadas tridimensionais. Os três eixos são ântero-posterior (AP), mediolateral (ML) e dorsoventral (DV), representando os eixos y, x e z no display digital de instrumentos estereotáxicos. Para regiões cerebrais bem conhecidas, os parâmetros de coordenadas estereotáxicas de uma área específica podem ser obtidos a partir de atlas cerebrais de camundongos4 (por exemplo, cérebro de camundongo de Paxinos e Franklin em coordenadas estereotáxicas) e / ou da literatura publicada 5,6. No entanto, uma validação adicional é necessária devido a variações no equipamento estereotáxico e na idade/populações de camundongos usados por diferentes pesquisadores.
A estrutura é a base da função. Os circuitos neurais formam a base para muitas funções cerebrais, como atividades cognitivas, emoções, memória, funções sensoriais e motoras1. Rotular a estrutura e manipular a atividade dos circuitos neurais são vitais para entender a função de um circuito neural específico. Nas últimas décadas, os traçadores neurais evoluíram ao longo de muitas gerações; pesquisas iniciais adotaram aglutinina de gérmen de trigo (WGA) e aglutinina phaseolus vulgaris (PHA) como traçadores anterógrados, e fluoroouro (FG), subunidade B da toxina da cólera (CTB), carbocianina como traçadores retrógrados. No entanto, ao contrário dos marcadores virais, esses traçadores neurais tradicionais não podem integrar genes exógenos ao hospedeiro, nem têm seletividade de tipo de célula. Atualmente, a estratégia viral tornou-se uma proposta importante durante a pesquisa básica em neurociência. Para diferentes fins de pesquisa, várias ferramentas virais podem ser selecionadas 7,8. Existem vírus não transsinápticos, vírus transmultissinápticos (retrógrados e anterógrados) e vírus transmonossinápticos (retrógrados e anterógrados). Cada categoria contém vários tipos com as respectivas características.
O processo de administração e expressão viral é altamente demorado e intensivo em recursos, muitas vezes levando semanas ou até mais. Dentre os vários vetores virais, o vírus adeno-associado tem sido identificado como um meio promissor para a entrega de genes, proporcionando uma ampla janela que varia de 3 a 8 semanas pós-injeção para o procedimento experimental 7,8. À medida que a VAA evolui, a análise pode ser realizada 2-3 semanas após a administração 9,10. Outros traçadores de circuitos neurais, como o vírus da pseudo-raiva (PRV) e o vírus da raiva (RV), também requerem um período de rastreamento de pelo menos 2-7 dias 11,12,13,14,15. Assim, uma verificação preliminar do local da injeção antes de observar os sinais de fluorescência é eficaz em termos de tempo e custo.
Para facilitar uma verificação simples e rápida das injeções estereotáxicas, neste estudo, um corante é administrado antes dos vetores virais, e a criossecção permite que os pesquisadores observem o local da injeção e o rastreiem dentro de 30 minutos após a injeção.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo descreveu uma estratégia estável para verificar a precisão das injeções cerebrais estereotáxicas 5,6 mais rápida e simplesmente antes do rastreamento viral, mas o aspecto insubstituível da expressão do gene repórter na região do cérebro é crucial para a rotulagem da região cerebral. O corante azul que usamos permitiu a visualização imediata do local da injeção.
Várias etapas críticas neste protocolo cont…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (concessão nº 82101249 para XY Sun), Fundação de Pesquisa de Pós-Doutorado da China (concessão nº 2022M722125 para XY Sun). Programa de Vela de Xangai (concessão NO. 21YF1425100 para SH Chen). Projeto Especial de Pesquisa Clínica da Comissão Municipal de Saúde de Xangai (concessão Nº 202340088 a J Zhou). Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (concessão Nº 82101262 a X Zhang, concessão Nº 82101287 a SH Chen).
Materials
| 1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3 | Hamilton | 65458-01 | |
| 200 μL pipette tips | biosharp | BS-200-T | |
| 20 mL syringe | Kindly group | ||
| 3%H2O2 solution | Lircon Company | ||
| 6-well plate | Shengyou Biotech | 20006 | |
| Anerdian | Likang High-tech | 31001002 | |
| Anti roll plate | Leica | 14047742497 | |
| BD insulin syringe | Becton,Dickinson and Company | 328421 | |
| Bend toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1050 | |
| Cellsens dimension software | Olympus | ||
| Cotton swab | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Dapi-Fluoromount-G | Southernbiotech | 0100-20 | |
| Drill | Longxiang | ||
| Fine brushes | HWAHONG | ||
| Fine scissors | Jinzhong | y00030 | |
| Fluorescent microscopy | Olympus | BX63 | |
| freezing microtome | Leica | CM1950 | |
| Hemostatic forceps straight with tooth | Jinzhong | J31010 | |
| Infusion needle 0.7 mm | Kindly group | ||
| Lidocaine hydrochloride injection | Harvest Pharmaceutical Company | 71230803 | |
| Magnifying glass | M&G Chenguang Stationery | ||
| Male C57/BL mice | The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory | ||
| Mice coronal brain slice mold | RWD Life Science | 68713 | |
| Microcentrifuge tube | biosharp | BS-02-P | |
| Microtome blades | Leica | 819 | |
| Ophthalmic ointment | Cisen Pharmaceutical Company | G23HDM9M4S5 | |
| paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Peristaltic pumps | Harvard Apparatus | 70-4507 | |
| Phosphate buffered saline | Servicebio | G4202 | |
| Piette 2-200 μL | thermofisher | 4642080 | |
| SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue | Beyotime | P0015A | |
| Shaving blades | BFYING | 91560618 | |
| Slides | Citotest Scientific | 188105 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68807 | |
| Straight toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1060 | |
| Syringe Holder | RWD Life Science | 68206 | |
| Tissue scissors | Jinzhong | J21040 | |
| Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
| Tribromoethanol | Aibei Biotechnology | M2910 |
Riferimenti
- Liu, D., et al. Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry. Pain. 159 (1), 175 (2018).
- Gan, Z., et al. Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex. Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).
- Laing, B. T., et al. Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior. Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).
- Perens, J., et al. Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system. Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).
- Adhikari, A., et al. Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear. Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).
- Tao, Y., et al. Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval. Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).
- Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).
- Ansarifar, S., et al. Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin. Mol Brain. 16 (1), 77 (2023).
- Gonzalez, T. J., et al. Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery. Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).
- Sun, X. Y., et al. Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice. Cell Rep. 42 (7), 112719 (2023).
- Koren, T., et al. Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses. Cell. 184 (25), 6211 (2021).
- Poller, W. C., et al. Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress. Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).
- Huang, L., et al. A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy. Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).
- Hu, Z., et al. A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment. Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).
- Du, W., et al. Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus. Cell Rep Methods. 3 (6), 100506 (2023).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , (2001).
