Validation préliminaire des coordonnées d’injection stéréotaxique par cryosectionnement
Summary
Le présent protocole décrit une stratégie pratique pour accélérer l’étape de vérification des coordonnées d’injection stéréotaxique avant d’effectuer le traçage viral à l’aide de colorants et de coupes congelées.
Abstract
L’injection stéréotaxique d’une région cérébrale spécifique constitue une technique expérimentale fondamentale en neurosciences fondamentales. Les chercheurs basent généralement leur choix de paramètres d’injection stéréotaxiques sur des atlas de cerveau de souris ou des documents publiés qui utilisaient différentes populations/âges de souris et différents équipements stéréotaxiques, ce qui nécessite une validation plus poussée des paramètres de coordonnées stéréotaxiques. L’efficacité de l’imagerie calcique, de la chimiogénétique et des manipulations optogénétiques repose sur l’expression précise des gènes rapporteurs dans la région d’intérêt, nécessitant souvent plusieurs semaines d’efforts. Ainsi, c’est une tâche qui prend du temps si les coordonnées de la région cérébrale cible ne sont pas vérifiées à l’avance. En utilisant un colorant approprié au lieu d’un virus et en mettant en œuvre la cryosection, les chercheurs peuvent observer le site d’injection immédiatement après l’administration du colorant. Cela facilite l’ajustement en temps opportun des paramètres de coordination dans les cas où il existe des écarts entre le site d’injection réel et la position théorique. De tels ajustements améliorent considérablement la précision de l’expression virale dans la région cible lors d’expériences ultérieures.
Introduction
Presque tous les outils modernes de neuromodulation, y compris l’enregistrement du calcium in vivo, les outils optogénétiques et chimiogénétiques, nécessitent l’utilisation de coordonnées stéréotaxiques pour cibler la zone cérébrale d’intérêt 1,2,3, formant la base de la manipulation neuronale. Les coordonnées stéréotaxiques des régions cérébrales de la souris sont définies par rapport à bregma et lambda, les points de repère osseux sur le crâne, formant le système de coordonnées stéréotaxiques dérivé du crâne. Bregma ou lambda peut servir de point zéro des coordonnées tridimensionnelles. Les trois axes sont antéropostérieur (AP), médiolatéral (ML) et dorso-ventral (DV), représentant les axes y, x et z sur l’affichage numérique des instruments stéréotaxiques. Pour les régions cérébrales bien connues, les paramètres de coordonnées stéréotaxiques d’une zone spécifique peuvent être obtenus à partir des atlas du cerveau de souris4 (par exemple, Paxinos et le cerveau de souris de Franklin en coordonnées stéréotaxiques) et/ou de la littérature publiée 5,6. Cependant, une validation supplémentaire est nécessaire en raison des variations dans l’équipement stéréotaxique et de l’âge/des populations de souris utilisées par différents chercheurs.
La structure est la base de la fonction. Les circuits neuronaux constituent la base de nombreuses fonctions cérébrales, telles que les activités cognitives, les émotions, la mémoire, les fonctions sensorielles et motrices1. L’étiquetage de la structure et la manipulation de l’activité des circuits neuronaux sont essentiels pour comprendre la fonction d’un circuit neuronal spécifique. Au cours des dernières décennies, les traceurs neuronaux ont évolué à travers de nombreuses générations. les premières recherches ont adopté l’agglutinine de germe de blé (WGA) et l’agglutinine de Phaseolus vulgaris (PHA) comme traceurs antérogrades, et l’or fluoré (FG), la sous-unité B de la toxine du choléra (CTB), la carbocyanine comme traceurs rétrogrades. Cependant, contrairement aux traceurs viraux, ces traceurs neuronaux traditionnels ne peuvent pas intégrer de gènes exogènes dans l’hôte, ni n’ont de sélectivité de type cellulaire. De nos jours, la stratégie virale est devenue une proposition importante dans la recherche fondamentale en neurosciences. À différentes fins de recherche, divers outils viraux peuvent être sélectionnés 7,8. Il existe des virus non transsynaptiques, des virus trans-multisynaptiques (rétrogrades et antérogrades) et des virus trans-monosynaptiques (rétrogrades et antérogrades). Chaque catégorie contient plusieurs types avec des caractéristiques respectives.
Le processus d’administration et d’expression virale est très chronophage et gourmand en ressources, prenant souvent des semaines, voire plus. Parmi divers vecteurs viraux, le virus adéno-associé a été identifié comme un moyen prometteur pour l’administration de gènes, offrant une large fenêtre allant de 3 à 8 semaines après l’injection pour la procédure expérimentale 7,8. Au fur et à mesure de l’évolution de l’AAV, l’analyse peut être effectuée 2 à 3 semaines après l’administration 9,10. D’autres traceurs des circuits neuronaux, tels que le virus de la pseudorage (PRV) et le virus de la rage (VR), nécessitent également une période de traçage d’au moins 2 à 7 jours 11,12,13,14,15. Ainsi, une vérification préliminaire du site d’injection avant d’observer les signaux de fluorescence est à la fois rapide et rentable.
Pour faciliter une vérification simple et rapide des injections stéréotaxiques, dans cette étude, un colorant est administré avant les vecteurs viraux, et la cryosection permet aux chercheurs d’observer le site d’injection et de le suivre dans les 30 minutes suivant l’injection.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article a décrit une stratégie stable pour vérifier la précision des injections cérébrales stéréotaxiques 5,6 plus rapidement et simplement avant le traçage viral, mais l’aspect irremplaçable de l’expression du gène rapporteur dans la région du cerveau est crucial pour le marquage de la région du cerveau. Le colorant bleu que nous avons utilisé a permis de visualiser immédiatement le site d’injection.
Plusieurs…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° 82101249 à XY Sun), Fondation de recherche postdoctorale de Chine (subvention n° 2022M722125 à XY Sun). Programme de voile de Shanghai (subvention n° 21YF1425100 à SH Chen). Projet spécial de recherche clinique de la Commission municipale de la santé de Shanghai (subvention n° 202340088 à J Zhou). Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° 82101262 à X Zhang, subvention n° 82101287 à SH Chen).
Materials
| 1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3 | Hamilton | 65458-01 | |
| 200 μL pipette tips | biosharp | BS-200-T | |
| 20 mL syringe | Kindly group | ||
| 3%H2O2 solution | Lircon Company | ||
| 6-well plate | Shengyou Biotech | 20006 | |
| Anerdian | Likang High-tech | 31001002 | |
| Anti roll plate | Leica | 14047742497 | |
| BD insulin syringe | Becton,Dickinson and Company | 328421 | |
| Bend toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1050 | |
| Cellsens dimension software | Olympus | ||
| Cotton swab | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Dapi-Fluoromount-G | Southernbiotech | 0100-20 | |
| Drill | Longxiang | ||
| Fine brushes | HWAHONG | ||
| Fine scissors | Jinzhong | y00030 | |
| Fluorescent microscopy | Olympus | BX63 | |
| freezing microtome | Leica | CM1950 | |
| Hemostatic forceps straight with tooth | Jinzhong | J31010 | |
| Infusion needle 0.7 mm | Kindly group | ||
| Lidocaine hydrochloride injection | Harvest Pharmaceutical Company | 71230803 | |
| Magnifying glass | M&G Chenguang Stationery | ||
| Male C57/BL mice | The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory | ||
| Mice coronal brain slice mold | RWD Life Science | 68713 | |
| Microcentrifuge tube | biosharp | BS-02-P | |
| Microtome blades | Leica | 819 | |
| Ophthalmic ointment | Cisen Pharmaceutical Company | G23HDM9M4S5 | |
| paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | |
| Peristaltic pumps | Harvard Apparatus | 70-4507 | |
| Phosphate buffered saline | Servicebio | G4202 | |
| Piette 2-200 μL | thermofisher | 4642080 | |
| SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue | Beyotime | P0015A | |
| Shaving blades | BFYING | 91560618 | |
| Slides | Citotest Scientific | 188105 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD Life Science | 68807 | |
| Straight toothed dissecting forceps | Jinzhong | JD1060 | |
| Syringe Holder | RWD Life Science | 68206 | |
| Tissue scissors | Jinzhong | J21040 | |
| Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
| Tribromoethanol | Aibei Biotechnology | M2910 |
Riferimenti
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