Monitoramento da Evolução Mecânica do Tecido Durante o Fechamento do Tubo Neural de Embrião de Pintinhos

Os defeitos do tubo neural (DTN) são graves defeitos congênitos do sistema nervoso central causados por falhas no fechamento do tubo neural (NTC) durante o desenvolvimento embrionário¹. A etiologia dos DTNs é complexa. Estudos têm mostrado que as NTC envolvem uma sequência de processos morfogenéticos, incluindo extensão convergente, flexão da placa neural (por exemplo, constrição apical), elevação da prega neural e, finalmente, adesão da prega neural. Esses processos são regulados por múltiplos mecanismos moleculares e genéticos ^2,3, e qualquer mau funcionamento desses processos pode resultar em DTNs ^4,5,6. Como evidências crescentes sugerem que pistas mecânicas também desempenham papéis cruciais durante as NTC3,7,8,9,10,11, e relações têm sido encontradas entre genes e pistas mecânicas 12,13,14, torna-se imperativo investigar a biomecânica tecidual durante a neurulação.

Várias técnicas têm sido desenvolvidas para medir as propriedades mecânicas de tecidos embrionários, incluindo ablação a laser (LA)¹⁵, dissecção e relaxamento tecidual (TDR)^16,17, aspiração por micropipeta (MA)¹⁸, nanoindentação baseada em Microscopia de Força Atômica (AFM)¹⁹, microindenters (MI) e microplacas (MP)²⁰, microrreologia (RM) com pinça óptica/magnética21,22,23e sensores baseados em gotículas²⁴. Os métodos existentes podem medir propriedades mecânicas em resoluções espaciais que variam de escalas subcelulares a teciduais. No entanto, a maioria desses métodos é invasiva porque requer contato com a amostra (por exemplo, MA, AFM, MI e MP), injeção de material externo (por exemplo, MR e sensores baseados em gotículas) ou dissecção tecidual (por exemplo, LA e TDR). Como resultado, é um desafio para os métodos existentes monitorar a evolução mecânica do tecido da placa neural in situ25. Recentemente, a elastografia reverberante de coerência óptica tem se mostrado promissora para o mapeamento mecânico sem contato com alta resolução^espacial26.

A microscopia confocal de Brillouin é uma modalidade óptica emergente que permite a quantificação sem contato da biomecânica tecidual com resolução subcelular27,28,29,30. A microscopia de Brillouin baseia-se no princípio do espalhamento espontâneo da luz de Brillouin, que é a interação entre a luz laser incidente e a onda acústica induzida por flutuações térmicas no interior do material. Consequentemente, a luz espalhada experimenta um deslocamento de frequência, conhecido como deslocamento ω_R de Brillouin, seguindo a equação³¹:

(1)

Aqui, é o índice de refração do material, λ é o comprimento de onda da luz incidente, M’ é o módulo longitudinal, ρ é a densidade de massa e θ é o ângulo entre a luz incidente e a luz espalhada. Para um mesmo tipo de material biológico, a relação entre índice de refração e densidade é aproximadamente constante 28,32,33,34,35,36. Assim, o desvio de Brillouin pode ser usado diretamente para estimar mudanças mecânicas relativas em processos fisiológicos. A viabilidade da microscopia de Brillouin foi validada em várias amostras biológicas 29,37,38. Recentemente, imagens mecânicas por lapso de tempo de um embrião de pintinho vivo foram demonstradas pela combinação de um microscópio Brillouin com um sistema de incubação no estágio³⁹. Este protocolo fornece descrições detalhadas da preparação da amostra, implementação do experimento e pós-processamento e análise dos dados. Esperamos que este esforço facilite a adoção generalizada da tecnologia Brillouin sem contato para estudar a regulação biomecânica no desenvolvimento embrionário e defeitos congênitos.