Monitoring van de mechanische evolutie van weefsel tijdens het sluiten van de neurale buis van kuikenembryo's

Neurale buisdefecten (NTD’s) zijn ernstige geboorteafwijkingen van het centrale zenuwstelsel die worden veroorzaakt door storingen in de neurale buissluiting (NTC) tijdens de embryonale ontwikkeling¹. De etiologie van NTD’s is complex. Studies hebben aangetoond dat NTC een opeenvolging van morfogenetische processen omvat, waaronder convergente extensie, buiging van de neurale plaat (bijv. apicale vernauwing), het verhogen van de neurale plooi en ten slotte adhesie van de neurale vouw. Deze processen worden gereguleerd door meerdere moleculaire en genetische mechanismen ^2,3, en elke storing in deze processen kan leiden tot NTD’s ^4,5,6. Aangezien er steeds meer bewijs is dat mechanische signalen ook een cruciale rol spelen tijdens NTC 3,7,8,9,10,11, en er relaties zijn gevonden tussen genen en mechanische signalen 12,13,14, wordt het noodzakelijk om de weefselbiomechanica tijdens neurulatie te onderzoeken.

Er zijn verschillende technieken ontwikkeld voor het meten van de mechanische eigenschappen van embryonale weefsels, waaronder laserablatie (LA)¹⁵, weefseldissectie en -ontspanning (TDR)^16,17, micropipetaspiratie (MA)¹⁸, nanoindentatie op basis van atoomkrachtmicroscopie (AFM)¹⁹, microindenters (MI) en microplaten (MP)²⁰, microreologie (MR) met optisch/magnetisch pincet^21,22,23, en druppelsensoren²⁴. Bestaande methoden kunnen mechanische eigenschappen meten bij ruimtelijke resoluties, variërend van subcellulaire tot weefselschalen. De meeste van deze methoden zijn echter invasief omdat ze contact met het monster vereisen (bijv. MA, AFM, MI en MP), externe materiaalinjectie (bijv. MR en druppelgebaseerde sensoren) of weefseldissectie (bijv. LA en TDR). Als gevolg hiervan is het voor bestaande methoden een uitdaging om de mechanische evolutie van neuraal plaatweefsel in situ^{te volgen 25}. Onlangs is galmende optische coherentie-elastografie veelbelovend gebleken voor contactloze mechanische mapping met een hoge ruimtelijke resolutie²⁶.

Confocale Brillouin-microscopie is een opkomende optische modaliteit die contactloze kwantificering van weefselbiomechanica mogelijk maakt met een subcellulaire resolutie^van 27,28,29,30. Brillouin-microscopie is gebaseerd op het principe van spontane Brillouin-lichtverstrooiing, de interactie tussen het invallende laserlicht en de akoestische golf die wordt veroorzaakt door thermische fluctuaties in het materiaal. Bijgevolg ondergaat het verstrooide licht een frequentieverschuiving, bekend als de Brillouin-verschuiving ω_R, volgens de vergelijking³¹:

(1)

Hier is de brekingsindex van het materiaal, λ is de golflengte van het invallende licht, M’ is de longitudinale modulus, ρ is de massadichtheid en θ is de hoek tussen het invallende licht en het verstrooide licht. Voor hetzelfde type biologische materialen is de verhouding tussen brekingsindex en dichtheid ongeveer constant 28,32,33,34,35,36. De Brillouin-verschuiving kan dus direct worden gebruikt om relatieve mechanische veranderingen in fysiologische processen te schatten. De haalbaarheid van Brillouin-microscopie is gevalideerd in verschillende biologische monsters 29,37,38. Onlangs werd time-lapse mechanische beeldvorming van een levend kuikenembryo gedemonstreerd door een Brillouin-microscoop te combineren met een incubatiesysteem op het podium³⁹. Dit protocol bevat gedetailleerde beschrijvingen van de voorbereiding van het monster, de uitvoering van het experiment en de nabewerking en analyse van gegevens. We hopen dat deze inspanning de wijdverbreide acceptatie van contactloze Brillouin-technologie zal vergemakkelijken voor het bestuderen van biomechanische regulatie in de ontwikkeling van embryo’s en geboorteafwijkingen.