Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo

Chenjun Shi; Chenchen Handler; Haden Florn; Jitao Zhang

doi:10.3791/66117

JoVE Journal > Developmental Biology

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Biologia dello sviluppo

병아리 배아의 신경관 폐쇄 중 조직의 기계적 진화 모니터링

Published: November 10, 2023

doi:

10.3791/66117

Chenjun Shi¹, Chenchen Handler², Haden Florn¹, Jitao Zhang¹

¹Department of Biomedical Engineering, College of Engineering,Wayne State University, ²Fischell Department of Bioengineering,University of Maryland

Summary

이 프로토콜은 병아리 배아 신경 형성 중 신경판 조직의 기계적 특성을 종단적으로 모니터링하기 위해 개발되었습니다. Brillouin 현미경과 무대 배양 시스템의 통합을 기반으로 하며, 배 양된 병아리 배아에서 신경판 조직의 실시간 기계적 이미징을 가능하게 합니다.

Abstract

신경관 폐쇄(NTC)는 배아 발달 과정에서 중요한 과정입니다. 이 과정에서 실패하면 신경관 결손이 발생하여 선천성 기형 또는 사망에 이를 수 있습니다. NTC는 유전적, 분자적, 기계적 수준에 대한 일련의 메커니즘을 포함합니다. 기계적 조절은 최근 몇 년 동안 점점 더 매력적인 주제가 되었지만, 3D 배아 조직의 현장 기계적 테스트를 수행하는 데 적합한 기술이 부족하기 때문에 대부분 탐구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이에 대응하여 우리는 비접촉 및 비침습적 방식으로 닭 배아 조직의 기계적 특성을 정량화하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 이는 컨포칼 Brillouin 현미경과 무대 배양 시스템을 통합함으로써 달성됩니다. 조직 역학을 조사하기 위해 사전 배양된 배아를 수집하여 난자 배양을 위한 무대 내 인큐베이터로 옮깁니다. 동시에, 신경판 조직의 기계적 이미지는 발달 중 서로 다른 시점에서 Brillouin 현미경에 의해 획득됩니다. 이 프로토콜에는 시료 전처리, Brillouin 현미경 실험 구현, 데이터 후처리 및 분석에 대한 자세한 설명이 포함되어 있습니다. 이 프로토콜을 따름으로써, 연구자들은 발달 중 배아 조직의 기계적 진화를 종단적으로 연구할 수 있습니다.

Introduction

신경관 결손(NTD)은 배아 발달 중 신경관 폐쇄(NTC)의 실패로 인해 발생하는 중추신경계의 심각한 선천적 결함이다¹. NTD의 원인은 복잡합니다. 연구에 따르면 NTC는 수렴 확장, 신경판의 굽힘(예: 정점 수축), 신경주름 상승, 마지막으로 신경주름 유착을 포함한 일련의 형태발생 과정을 포함합니다. 이러한 과정은 여러 분자 및 유전 메커니즘에 의해 조절되며^2,3 이러한 과정에서 오작동이 발생하면 NTD ^4,5,6이 발생할 수 있습니다. NTC 3,7,8,9,10,11 동안 기계적 단서가 중요한 역할을 한다는 증거가 늘어나고 유전자와 기계적 단서 ^12,13,14 사이의 관계가 발견됨에 따라, 신경관형성 중 조직 생체역학을 조사하는 것이 필수적이다.

배아 조직의 기계적 특성을 측정하기 위해 레이저 절제(LA)¹⁵, 조직 해부 및 이완(TDR)^16,17, 마이크로피펫 흡인(MA)¹⁸, 원자력 현미경(AFM) 기반 나노인덴테이션(¹⁹), 마이크로인덴터(MI) 및 마이크로플레이트(MP)²⁰, 광학/자기 핀셋을 사용한 마이크로 유변학(MR)^21,22,23 등 여러 기술이 개발되었습니다및 물방울 기반 센서(²⁴)를 사용할 수 있다. 기존 방법은 세포 하에서 조직 규모에 이르는 공간 분해능에서 기계적 특성을 측정할 수 있습니다. 그러나 이러한 방법의 대부분은 샘플과의 접촉(예: MA, AFM, MI 및 MP), 외부 물질 주입(예: MR 및 액적 기반 센서) 또는 조직 해부(예: LA 및 TDR)가 필요하기 때문에 침습적입니다. 결과적으로, 기존 방법으로는 25번 제자리에서 신경판 조직의 기계적 진화를 모니터링하기가 어렵습니다. 최근에, 잔향 광간섭 엘라스토그래피(reverberant optical coherence elastography)는 높은 공간 분해능(²⁶)을 갖는 비접촉식 기계적 매핑에 대한 가능성을 보여주었다.

Confocal Brillouin 현미경은 세포 내 분해능 27,28,29,30으로 조직 생체 역학의 비접촉 정량화를 가능하게 하는 새로운 광학 양식입니다. Brillouin 현미경은 입사 레이저 광과 재료 내의 열 변동에 의해 유도된 음파 사이의 상호 작용인 자발적 Brillouin 광 산란의 원리를 기반으로 합니다. 결과적으로, 산란광은 방정식³¹에 따라 Brillouin shift ω_R로 알려진 주파수 이동을 경험합니다.

(1)

여기서, 는 물질의 굴절률, λ는 입사광의 파장, M’은 종계수, ρ는 질량 밀도, θ는 입사광과 산란광 사이의 각도입니다. 동일한 유형의 생물학적 물질에 대해 굴절률과 밀도 의 비율은 대략 일정합니다 28,32,33,34,35,36. 따라서 Brillouin shift는 생리적 과정의 상대적인 기계적 변화를 추정하는 데 직접 사용할 수 있습니다. Brillouin 현미경의 타당성은 다양한 생물학적 샘플 29,37,38에서 검증되었습니다. 최근에, 살아있는 병아리 배아의 타임랩스 기계적 이미징이 브릴루앙 현미경과 무대 배양 시스템⁽³⁹)을 결합함으로써 시연되었다. 이 프로토콜은 시료 전처리, 실험 구현, 데이터 후처리 및 분석에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 우리는 이러한 노력이 배아 발달 및 선천적 결함의 생체역학적 조절을 연구하기 위한 비접촉식 Brillouin 기술의 광범위한 채택을 촉진하기를 희망합니다.

Protocol

이 프로토콜은 Wayne State University의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 1. 실험 준비 70% 에탄올 용액을 사용하여 가위와 핀셋을 청소하고 살균하십시오. 또한 일회용 피펫과 주사기를 준비하십시오. 탈이온수 495mL에 NaCl 3.595g을 첨가하여 세척액을 준비합니다. 그런 다음 페니실린-스트렙토마이신 5ml(5U/mL)를 배지에 추가합니다. 100m…

Representative Results

그림 6 은 Brillouin 현미경의 개략도를 보여줍니다. 이 시스템은 660nm 레이저를 광원으로 사용합니다. 아이솔레이터는 레이저 헤드 바로 뒤에 배치되어 역반사광을 차단하고 중성 밀도(ND) 필터를 사용하여 레이저 출력을 조정합니다. 초점 거리가 각각 f1 = 16mm 및 f2 = 100mm인 한 쌍의 렌즈 L1 및 L2가 레이저 빔을 확장하는 데 사용됩니다. 반파장판(HWP)과 선형 편광판(편광판 1)을 사…

Discussion

배아의 초기 발달은 외부 교란에 의해 쉽게 영향을 받을 수 있습니다. 따라서 시료 추출 및 이송 시 각별한 주의가 필요합니다. 한 가지 잠재적인 문제는 여과지에서 배아가 분리되는 것인데, 이로 인해 비텔린 막이 수축되어 Brillouin 이미징에서 신경판의 기울어진 아티팩트가 발생할 수 있습니다. 더욱이, 이러한 수축은 배아의 발달을 중단시킬 수 있습니다. 분리를 방지하기 위해 몇 가지 중요한 …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 유니스 케네디 슈라이버 국립 아동 보건 및 인간 발달 연구소(Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development), 미국 국립보건원(National Institutes of Health, K25HD097288, R21HD112663)의 지원을 받습니다.

Materials

100 mm Petri dish	Fisherbrand	FB0875713
2D motorized stage	Prior Scientific	H117E2
35 mm Petri dish	World Precision Instruments	FD35-100
Brillouin Microscope with on-stage incubator	N/A	N/A	This is a custom-built Brillouin Microscope system based on Ref. 30
Chicken eggs	University of Connecticut	N/A
CMOS camera	Thorlabs	CS2100M-USB
EMCCD camera	Andor	iXon
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	#2701
Filter paper	Whatman	1004-070
Incubator for in ovo culture	GQF Manufacturing Company Inc.	GQF 1502
Ring	Thorlabs	SM1RR
Microscope body	Olympus	IX73
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
On-stage incubator	Oko labs	OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm	Bemis	PM-996
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063
Pipettes	Fisherbrand	13-711-6M
Scissors	Artman instruments	N/A	3pc Micro Scissors 5
Syringe	BD	305482
Tissue paper	Kimwipes	N/A
Tube	Corning	430052
Tweezers	DR Instruments	N/A	Microdissection Forceps Set

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Citazione di questo articolo

Shi, C., Handler, C., Florn, H., Zhang, J. Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo. J. Vis. Exp. (201), e66117, doi:10.3791/66117 (2023).