Histon Asetiltransferaz 1 Asetilasyonunu Ölçmek için Bir Asetil-Tıklama Kimyası Testi
Summary
Spesifik inhibitörleri taramak için hızlı ve doğru kimyasal tahliller, ilaç geliştirme cephaneliğinde önemli bir araçtır. Burada, HAT1 asetilasyon aktivitesinin inhibisyonunu ölçmek için ölçeklenebilir bir asetil-tıklama kimyası testi sunuyoruz.
Abstract
Histon asetiltransferaz 1 olarak da bilinen HAT1, nükleozom montajından önce ortaya çıkan H4’ü stabilize ederek ve asetilleyerek kromatin sentezinde çok önemli bir rol oynar. Çeşitli sistemlerde tümör büyümesi için gereklidir, bu da onu kanser tedavisi için potansiyel bir hedef haline getirir. HAT1 enzimatik aktivitesini inhibe edebilen bileşiklerin tanımlanmasını kolaylaştırmak için, hızlı tarama için bir asetil-tıklama testi tasarladık. Bu basit tahlilde, aktive edilmiş insan hücrelerinden saflaştırılan rekombinant HAT1 / Rbap46 kullanıyoruz. Yöntem, bir tıklama kimyası yaklaşımında asetil-CoA analoğu 4-pentinoil-CoA’yı (4P) kullanır. Bu, bir alkin sapının, HAT1’e bağlı bir asilasyon reaksiyonu yoluyla biyotinillenmiş bir H4 N-terminal peptidine enzimatik transferini içerir. Yakalanan peptit daha sonra nötravidin plakaları üzerinde hareketsiz hale getirilir, ardından biyotin-azid ile tıklama kimyası işlevselleştirilmesi yapılır. Daha sonra, amplex kırmızısını oksitlemek için streptavidin-peroksidaz alımı kullanılır ve bu da kantitatif bir floresan çıktısı ile sonuçlanır. Asilasyon reaksiyonu sırasında kimyasal inhibitörler ekleyerek, floresan sinyalinin azalmasına dayalı olarak enzimatik inhibisyonu ölçebiliriz. Daha da önemlisi, bu reaksiyon ölçeklenebilir ve HAT1 enzimatik aktivitesi için potansiyel inhibitörlerin yüksek verimli taranmasına izin verir.
Introduction
Çok sayıda ökaryotik asetiltransferaz arasında HAT1,izole edilecek ilk histon asetiltransferazdı 1,2,3. Daha sonraki araştırmalar, kromatin replikasyonunda, özellikle S-fazı4 sırasında yeni nükleozomların sentezinde önemli rolünü sağlam bir şekilde ortaya koymuştur. Araştırma çabalarımız, HAT1’in meme hücrelerindeepidermal büyüme faktörü (EGF) tedavisi ile yüksek oranda uyarıldığının kabul edilmesine yol açmıştır 5. Ayrıca, HAT1’in hızlı hücre proliferasyonu ve tümör oluşumu için gerekli olduğu ortaya çıkmıştır in vivo 6,7,8,9. Veriler, HAT1’in hücre bölünmesi için anabolik ve epigenetik süreçleri koordine etmede kritik olduğunu ve tümör büyümesini yönlendirdiğini göstermektedir.
HAT1, histon H4’ün amino terminal kuyruğunu, histonu bağlayan ve amino terminalini HAT1’e sunan şaperon proteini Rbap46 ile kompleks halinde lizin 5 ve 12 üzerinde di-asetillenir. Histon tetramerleri veya disomları10, HAT1/Rbap46 ve diğer histon şaperonları11 ile birlikte daha sonra çekirdeğe aktarılır. Histonlar daha sonra replikasyon çatalında veya gen aktivasyonunu veya baskılanmasını desteklemek için diğer bölgelerde biriktirilmek üzere serbest bırakılır. HAT1 di-asetilasyon işaretinin histon H4 üzerindeki işlevi tam olarak anlaşılmamıştır. H4 kromatine yerleştirildikten sonrahiston deasetilaz 12,13,14,15’in etkisiyle 15-30 dakikalık bir süre içinde muhtemelen hızlı bir şekilde çıkarılır. Bu nedenle, HAT1 di-asetilasyon işareti kromatin içinde yayılmaz ve kromatin modifiye edici enzimlerin yeni ortaya çıkan kromatine alınmasında bir rol olduğu öne sürülmesine rağmen, gerçek bir epigenetik role hizmet etmeyebilir12. Ayrıca, HAT1 kromatini doğrudan asetillemez; Aktivitesi çözünür histonlarla sınırlıdır.
Küçük moleküllü histon asetiltransferaz inhibitörlerinin geliştirilmesi, spesifik olmayan ve düşük verimli deneyler tarafından engellenmiştir ve bu da genellikle biyolojik olarak reaktif bileşiklerinüretilmesine neden olmuştur 16,17. Asetiltransferaz aktivitelerini ölçmek için altın standart tahlil, verimi sınırlayan ve radyasyon gerektiren 3H-asetil-coA kullanımını gerektirir. Bununla birlikte, son zamanlarda, CBP / p30018 ve KAT6A / B 19,20’yi hedefleyen spesifik ve oldukça güçlü küçük moleküllü asetiltransferaz inhibitörleri tanımlanmış ve 3H-asetil-CoA kullanımı ile doğrulanmıştır. İleriye dönük olarak, daha iyi verim elde etmek ve laboratuvar tehlikelerinden kaçınmak için geliştirilmiş tahliller tasarlanmaktadır.
Asetilasyon izleme21’deki son gelişmeler, enzimatik reaksiyon izlemeyi sağlamak için tıklama kimyasını kullanmıştır. Basit sentetik yollarla erişilebilen veya enzim reaksiyonlarına dahil edilebilen satın alınabilen çeşitli tıklama özellikli öncüler vardır. Bu reaksiyonlar tipik olarak rekombinant sistemlerde gerçekleştirilir, ancak hücre bazlı tahliller de mümkündür22. Tıklama özellikli kofaktörlerin ve substratların avantajı, taramanın, genellikle tarama bileşikleri tarafından bozulan ve ek işleme adımları gerektiren birleştirilmiş okuma sistemlerine ihtiyaç duymadan enzim aktivitesini doğrudan ölçebilmesidir. Bu, inhibitör tedavilerine yalnızca enzimatik adım sırasında izin verirken, tüm aşağı akış işlevselleştirme ve tespit adımları, bileşikleri uzaklaştırmak için kapsamlı yıkamadan sonra gerçekleştirilir, böylece tahlil girişiminin meydana gelme potansiyelini sınırlar. Bu avantajlar, tıklama özellikli testlerin tasarımını, genellikle serbest koenzim A’nın saptanmasına dayanan birleştirilmiş tahlillere tercih edilir hale getirir.
Önemli bir husus, tıklama özellikli kofaktörlerin enzim aktif bölgesine kabul edilmesidir. Mevcut tıklamanın etkin olduğu ortak faktörler, yerel ortak faktör için optimize edilmiş etkin siteyle tam olarak uyumlu olmayabilir. Yapısal bilgi ve modelleme, değiştirilmiş substratları dahil etmek için aktif bölgeyi genişletmek için amino asit ikamelerini tasarlamak için kullanılabilir23. Bu, gelişmiş enzim kinetiği ve daha düşük substrat ve enzim seviyeleri ile taramayı mümkün kılabilir. Bu yaklaşımın dezavantajı, değiştirilmiş katalitik ceplerin, doğal enzimle güçlü bir şekilde etkileşime giren inhibitörleri tanımlayamamasıdır. Sonuç olarak, potansiyel enzim inhibitörlerini tanımlamak ve doğrulamak için yaklaşımların bir kombinasyonu gereklidir.
Burada, tıklama ko-faktörü 4-pentinoil-CoA24 kullanarak HAT1 enzim aktivitesini saflaştırmak ve test etmek için geliştirilmiş bir yöntemi açıklıyoruz. Bu test (Şekil 1), enzim aktivitesini arttırdığı gösterilen gerekli ortak proteini Rbap46 ile kompleks halinde doğal enzim dizisini kullanır. Enzimin insan hücrelerinden saflaştırılması, tam enzim aktivitesi için önemli olan uyarıcı translasyon sonrası modifikasyonları koruyabilen selülde enzim aktivasyonuna izin verir. Yüksek verimli kimyasal ekranlar için rekombinant enzim deneylerinin tasarımı ve optimizasyonu, HAT1 küçük molekül inhibitörlerini tanımlamak ve karakterize etmek için başarıyla kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Son on yılda, tıklama kimyası öne çıktı20 ve etkileşen kimyasal yapıların hassas tasarımını mümkün kıldı. Bu bağlamda, çeşitli biyoortogonal kovalent bağlantılar21 doğal ortamlarında kompleksler oluşturmak için umut verici seçenekler olarak ortaya çıkmıştır. Tıklama kimyası, genellikle “tıklama reaksiyonları” olarak bilinen hızlı ve seçici reaksiyonlar sergileyen fonksiyonel grup çiftlerini kullanır. Bu reaksiyonlar, çevre dostu, yu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
George Zheng’e H4K12CoA’yı sağladığı için teşekkür ederiz. Yararlı tartışmalar ve geri bildirimler için Gruber Lab üyelerine teşekkür ederiz. NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) ve V Vakfı’nın (V2022-022) desteğine teşekkür ederiz.
Materials
| 4P CoA | Cayman Chemical | 10547 | Click chemistry co-factor |
| Amplex Red | Fisher Sci | A12222 | Fluorescence substrate |
| Biotin-PEG-Azide | Alfa Aesar | J64996MC | Click chemistry |
| Copper Sulfate | Sigma-aldrich | 7758-98-7 | Click chemistry |
| DMSO | Fisher Scientific | 67-68-5 | diluent |
| DTT | Acros Organics | 03-12-3483 | reducting agent |
| Forskolin | VWR | 102987-310 | Protein expression |
| Freestyle 293 Expression Medium | Thermo Fisher | 12338018 | Media |
| Freestyle 293-F cells | Thermo Fisher | R790-07 | Protein expression |
| H4-peptide/1-23-GGK-biotin | Anaspec | AS65097 | peptide substrate |
| HEPES | Sigma-aldrich | 7365-45-9 | EB buffer |
| Hydrogen peroxide 30% solution | Sigma-aldrich | Z00183-99-0 | initiator |
| M2 FLAG antibody slurry | Millipore-Sigma | A2220 | Protein purification |
| Macrosep 10K Filter (Pall Lab) | VWR | 89131-980 | Protein purification |
| Neutravidin Plate | Thermo Sci | 15127 | BSA-pre-blocked |
| NP40 (IGEPAL) | MP Biomedical | 198596 | 20x buffer |
| pHEK-293 plasmid | Takara Bio | 3390 | Protein expression |
| Phosphate Buffered Saline 10x | Alfa Aesar | Z00082-33-6 | wash buffer |
| Pra peptide | Genscript | Custom synthesis | biotinylated |
| Sodium Ascorbate | Sigma-aldrich | 134-03-2 | Click chemistry |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich | 7647-14-5 | EB buffer |
| Sodium phosphate | VWR International | 7558-80-7 | buffer |
| Streptavidin | EMD Millipore | 189730 | competitor |
| Streptavidin-HRP | Cell Signaling | 3999S | enzyme |
| THPTA ligand | Fisher Sci | 1010-500 | Click chemistry |
| Tris base | Sigma-aldrich | 77-86-1 | 20x buffer |
| Triton-X 100 | VWR International | 9002-93-1 | EB buffer |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | 9005-64-5 | Wash buffer |
| Urea | Sigma-Aldrich | 57-13-6 | quencher |
Riferimenti
- Kleff, S., et al. Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase. J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).
- Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism. Cell. 87 (1), 85-94 (1996).
- Verreault, A., et al. Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase. Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).
- Parthun, M. R. Histone acetyltransferase 1: more than just an enzyme. Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 256-263 (2013).
- Gruber, J. J., et al. HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding. Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).
- Fan, P., et al. Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47 (2019).
- Xia, P., et al. MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis. J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).
- Yang, G., et al. Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis. EMBO Rep. 22 (2), e50967 (2021).
- Xue, L., et al. RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma. Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).
- Zhang, W., et al. Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).
- Campos, E. I., et al. The program for processing newly synthesized histones H3.1 and H4. Nat Struct Mol Biol. 17 (11), 1343-1351 (2010).
- Agudelo Garcia, P. A., et al. Identification of multiple roles for histone acetyltransferase 1 in replication-coupled chromatin assembly. Nucleic Acids Res. 45 (16), 9319-9335 (2017).
- Nagarajan, P., et al. Histone acetyl transferase 1 is essential for mammalian development, genome stability, and the processing of newly synthesized histones H3 and H4. PLoS Genet. 9 (6), e1003518 (2013).
- Annunziato, A. T. Assembling chromatin: the long and winding road. Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 196-210 (2013).
- Annunziato, A. T., Seale, R. L. Histone deacetylation is required for the maturation of newly replicated chromatin. J Biol Chem. 258 (20), 12675-12684 (1983).
- Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nat Commun. 8 (1), 1527 (2017).
- Baell, J. B., Miao, W. Histone acetyltransferase inhibitors: where art thou. Future Med Chem. 8 (13), 1525-1528 (2016).
- Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
- Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
- Falk, H., et al. An efficient high-throughput screening method for MYST family acetyltransferases, a new class of epigenetic drug targets. J Biomol Screen. 16 (10), 1196-1205 (2011).
- He, M., et al. Chemical biology approaches for investigating the functions of lysine acetyltransferases. Angew Chem Int Ed Engl. 57 (5), 1162-1184 (2018).
- Lipchik, A. M., et al. A peptide-based biosensor assay to detect intracellular Syk kinase activation and inhibition. Biochimica. 51 (38), 7515-7524 (2012).
- Song, J., et al. Chemoproteomic profiling of protein substrates of a major lysine acetyltransferase in the native cellular context. ACS Chem Biol. 17 (5), 1092-1102 (2022).
- Gaddameedi, J. D., et al. Acetyl-click screening platform identifies small-molecule inhibitors of histone acetyltransferase 1 (HAT1). J Med Chem. 66 (8), 5774-5801 (2023).
- Ngo, L., Brown, T., Zheng, Y. G. Bisubstrate inhibitors to target histone acetyltransferase 1 (HAT1). Chem Biol Drug Des. 93 (5), 865-873 (2019).
- Parker, C. G., Pratt, M. R. Click chemistry in proteomic investigations. Cell. 180 (4), 605-632 (2020).
- Islam, K. The bump-and-hole tactic: Expanding the scope of chemical genetics. Cell Chem Biol. 25 (10), 1171-1184 (2018).
- Radziwon, K., Weeks, A. M. Protein engineering for selective proteomics. Curr Opin Chem Biol. 60, 10-19 (2021).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature. J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).
