Summary

Aislamiento intestinal de larvas de pez cebra para la secuenciación de ARN de una sola célula

Published: November 10, 2023
doi:

Summary

Aquí, describimos un método para el aislamiento intestinal de larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización, para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula.

Abstract

El tracto gastrointestinal (GI) realiza una serie de funciones esenciales para la vida. Los defectos congénitos que afectan a su desarrollo pueden dar lugar a trastornos neuromusculares entéricos, lo que pone de manifiesto la importancia de comprender los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la disfunción gastrointestinal. En este estudio, presentamos un método para el aislamiento intestinal de larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización para obtener células vivas y viables que se pueden utilizar para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq). Este protocolo se basa en la disección manual del intestino del pez cebra, seguida de la disociación enzimática con la papaína. Posteriormente, las células se someten a una clasificación celular activada por fluorescencia y las células viables se recolectan para la secuenciación de scRNA. Con este método, pudimos identificar con éxito diferentes tipos de células intestinales, incluidas las células epiteliales, estromales, sanguíneas, musculares e inmunitarias, así como las neuronas entéricas y la glía. Por lo tanto, consideramos que es un recurso valioso para estudiar la composición del tracto gastrointestinal en la salud y la enfermedad, utilizando el pez cebra.

Introduction

El tracto gastrointestinal (GI) es un sistema complejo que desempeña un papel vital en la salud y el bienestar general. Es responsable de la digestión y absorción de nutrientes, así como de la eliminación de productos de desecho 1,2. El tracto gastrointestinal está compuesto por múltiples tipos de células, incluidas las células epiteliales, las células del músculo liso, las células inmunitarias y el sistema nervioso entérico (SNE), que se comunican estrechamente entre sí para regular y mantener una función intestinal adecuada 3,4,5. Los defectos en el desarrollo del tracto gastrointestinal pueden tener efectos de gran alcance en diversos aspectos, como la absorción de nutrientes, la composición de la microbiota, el eje intestino-cerebro y el SNE, lo que conduce a varios trastornos neuromusculares entéricos, como la enfermedad de Hirschsprung y la pseudoobstrucción intestinal crónica 6,7. Estos trastornos se caracterizan por una dismotilidad intestinal severa causada por alteraciones en varias células clave, como las células intersticiales de Cajal, las células musculares lisas y el SNE 6,8,9. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la disfunción gastrointestinal aún no se conocen bien.

El pez cebra es un organismo modelo valioso para estudiar el desarrollo y la disfunción gastrointestinal debido a su rápido desarrollo embrionario, transparencia durante las etapas embrionaria y larvaria, y trazabilidad genética 10,11,12,13,14. Se dispone de numerosas líneas transgénicas de pez cebra que expresan proteínas fluorescentes. Un ejemplo de este tipo de línea es el pez cebra tg(phox2bb:GFP), comúnmente utilizado para estudiar el SNE, ya que todas las células phox2bb+, incluidas las neuronas entéricas, están marcadas como15,16. Aquí, utilizando la línea de pez cebra tg(phox2bb:GFP), presentamos un método para el aislamiento intestinal de larvas 5 días después de la fertilización (dpf) para el análisis de secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) (Figura 1).

Protocol

Toda la cría y los experimentos de pez cebra se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales de la legislación Erasmus MC y de bienestar animal. El uso de larvas de pez cebra a los 5 días después de la fertilización entra en la categoría de experimentos que no requieren aprobación ética formal, como se describe en las regulaciones holandesas. 1. Obtención de larvas de tipo silvestre y tg (phox2bb:GFP) 5 días después de la fertilización (dpf)</strong…

Representative Results

Con este protocolo, logramos aislar y disociar con éxito intestinos enteros de larvas de 5 dpf. Utilizando papaína como enzima de disociación, mejoramos significativamente la viabilidad celular, permitiendo la captura de 46.139 eventos que involucraron células individuales viables (6,4% de todas las células) de 244 intestinos aislados (Figura 2A). Se utilizaron larvas enteras de tipo salvaje como control para garantizar que se optimizara el proceso de clasificación, lo que permitió un…

Discussion

Aquí, presentamos un método para el aislamiento y disociación del intestino de larvas de pez cebra de 5 dpf utilizando FACS. Con este método, se recolectaron y analizaron con éxito diferentes tipos de células intestinales mediante scRNA-seq, utilizando la plataforma 10x Genomics Chromium. Seleccionamos la línea de pez cebra tg(phox2bb:GFP), ya que queríamos una indicación de que las células viables del SNE también se aislarían (Figura 2D). Sin embargo, es importante tene…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por la Fundación de Amigos de Sophia (SSWO WAR-63).

Materials

10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) Sigma 59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap Falcon 352235
Agarose Sigma-Aldrich A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap BD Biosciences 352054
Cell Ranger v3.0.2 10X Genomics N/A
DAPI Sigma-Aldrich Cat#D-9542
Dissection microscope Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine BD Biosciences N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2 Gibco 14025050
Insect pins Fine Science Tools 26000-25
L-Cysteine Sigma C7352
MS-222, Tricaine Supelco A5040-250G
Papain Sigma P4762
Seurat v3 Stuart et al. (2019) N/A
Trypan blue  Sigma  Cat#T8154

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Kakiailatu, N. J. M., Kuil, L. E., Bindels, E., Zink, J. T. M., Vermeulen, M., Melotte, V., Alves, M. M. Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (201), e65876, doi:10.3791/65876 (2023).

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