Isolement intestinal de larves de poisson-zèbre pour le séquençage de l’ARN unicellulaire
Summary
Nous décrivons ici une méthode d’isolement intestinal des larves de poisson-zèbre 5 jours après la fécondation, pour l’analyse du séquençage de l’ARN unicellulaire.
Abstract
Le tractus gastro-intestinal (GI) remplit une série de fonctions essentielles à la vie. Les malformations congénitales affectant son développement peuvent entraîner des troubles neuromusculaires entériques, d’où l’importance de comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement et au dysfonctionnement gastro-intestinal. Dans cette étude, nous présentons une méthode d’isolement intestinal des larves de poisson-zèbre 5 jours après la fécondation afin d’obtenir des cellules vivantes et viables qui peuvent être utilisées pour l’analyse du séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq). Ce protocole est basé sur la dissection manuelle de l’intestin du poisson-zèbre, suivie d’une dissociation enzymatique avec de la papaïne. Par la suite, les cellules sont soumises à un tri cellulaire activé par fluorescence et les cellules viables sont collectées pour le scRNA-seq. Grâce à cette méthode, nous avons réussi à identifier différents types de cellules intestinales, notamment les cellules épithéliales, stromales, sanguines, musculaires et immunitaires, ainsi que les neurones entériques et les cellules gliales. Par conséquent, nous considérons qu’il s’agit d’une ressource précieuse pour étudier la composition du tractus gastro-intestinal dans la santé et la maladie, en utilisant le poisson-zèbre.
Introduction
Le tractus gastro-intestinal (GI) est un système complexe qui joue un rôle essentiel dans la santé et le bien-être en général. Il est responsable de la digestion et de l’absorption des nutriments, ainsi que de l’élimination des déchets 1,2. Le tractus gastro-intestinal est composé de plusieurs types de cellules, y compris les cellules épithéliales, les cellules musculaires lisses, les cellules immunitaires et le système nerveux entérique (SNE), qui communiquent étroitement entre elles pour réguler et maintenir une fonction intestinale appropriée 3,4,5. Les défauts dans le développement du tractus gastro-intestinal peuvent avoir des effets considérables sur divers aspects tels que l’absorption des nutriments, la composition du microbiote, l’axe intestin-cerveau et le SNE, conduisant à plusieurs troubles neuromusculaires entériques, tels que la maladie de Hirschsprung et la pseudo-obstruction intestinale chronique 6,7. Ces troubles sont caractérisés par une dysmotilité intestinale sévère causée par des altérations de diverses cellules clés, telles que les cellules interstitielles de Cajal, les cellules musculaires lisses et l’ENS 6,8,9. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement et au dysfonctionnement gastro-intestinal sont encore mal compris.
Le poisson-zèbre est un organisme modèle précieux pour l’étude du développement et du dysfonctionnement gastro-intestinal en raison de son développement embryonnaire rapide, de sa transparence pendant les stades embryonnaire et larvaire et de sa tractabilité génétique 10,11,12,13,14. De nombreuses lignées transgéniques de poissons-zèbres exprimant des protéines fluorescentes sont disponibles. Un exemple d’une telle lignée est le poisson-zèbre tg(phox2bb :GFP), couramment utilisé pour étudier le SNE, car toutes les cellules phox2bb+, y compris les neurones entériques, sont étiquetées15,16. Ici, en utilisant la lignée de poisson-zèbre tg(phox2bb :GFP), nous présentons une méthode d’isolement intestinal de larves 5 jours après la fécondation (dpf) pour l’analyse du séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) (Figure 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons ici une méthode d’isolement et de dissociation de l’intestin de 5 larves de poisson-zèbre dpf à l’aide de FACS. Grâce à cette méthode, différents types de cellules intestinales ont été collectés et analysés avec succès par scRNA-seq, à l’aide de la plateforme 10x Genomics Chromium. Nous avons sélectionné la lignée de poisson-zèbre tg(phox2bb :GFP), car nous voulions une indication que les cellules ENS viables seraient également isolées (Figure 2D<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par les amis de la Fondation Sophia (SSWO WAR-63).
Materials
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
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