Isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula
Summary
Qui, descriviamo un metodo per l’isolamento intestinale da larve di pesce zebra a 5 giorni dopo la fecondazione, per l’analisi del sequenziamento dell’RNA a singola cellula.
Abstract
Il tratto gastrointestinale (GI) svolge una serie di funzioni essenziali per la vita. I difetti congeniti che ne influenzano lo sviluppo possono portare a disturbi neuromuscolari enterici, evidenziando l’importanza di comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale. In questo studio, presentiamo un metodo per l’isolamento intestinale da larve di zebrafish a 5 giorni dopo la fecondazione per ottenere cellule vive e vitali che possono essere utilizzate per l’analisi del sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq). Questo protocollo si basa sulla dissezione manuale dell’intestino del pesce zebra, seguita dalla dissociazione enzimatica con la papaina. Successivamente, le cellule vengono sottoposte a selezione cellulare attivata dalla fluorescenza e le cellule vitali vengono raccolte per scRNA-seq. Con questo metodo, siamo stati in grado di identificare con successo diversi tipi di cellule intestinali, tra cui cellule epiteliali, stromali, del sangue, muscolari e immunitarie, nonché neuroni enterici e glia. Pertanto, lo consideriamo una risorsa preziosa per studiare la composizione del tratto gastrointestinale in salute e malattia, utilizzando il pesce zebra.
Introduction
Il tratto gastrointestinale (GI) è un sistema complesso che svolge un ruolo fondamentale nella salute e nel benessere generale. È responsabile della digestione e dell’assorbimento dei nutrienti, nonché dell’eliminazione dei prodotti di scarto 1,2. Il tratto gastrointestinale è composto da più tipi di cellule, tra cui cellule epiteliali, cellule muscolari lisce, cellule immunitarie e sistema nervoso enterico (ENS), che comunicano strettamente tra loro per regolare e mantenere la corretta funzione intestinale 3,4,5. I difetti nello sviluppo del tratto gastrointestinale possono avere effetti di vasta portata su vari aspetti come l’assorbimento dei nutrienti, la composizione del microbiota, l’asse intestino-cervello e l’ENS, portando a diversi disturbi neuromuscolari enterici, come la malattia di Hirschsprung e la pseudo-ostruzione intestinale cronica 6,7. Questi disturbi sono caratterizzati da una grave dismotilità intestinale causata da alterazioni in varie cellule chiave, come le cellule interstiziali di Cajal, le cellule muscolari lisce e l’ENS 6,8,9. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale sono ancora poco compresi.
Il pesce zebra è un prezioso organismo modello per lo studio dello sviluppo e della disfunzione gastrointestinale grazie al suo rapido sviluppo embrionale, alla trasparenza durante le fasi embrionali e larvali e alla trattabilità genetica 10,11,12,13,14. Sono disponibili numerose linee di zebrafish transgenici che esprimono proteine fluorescenti. Un esempio di tale linea è il pesce zebra tg(phox2bb:GFP), comunemente usato per studiare l’ENS, poiché tutte le cellule phox2bb+, compresi i neuroni enterici, sono marcate15,16. Qui, utilizzando la linea di zebrafish tg(phox2bb:GFP), presentiamo un metodo per l’isolamento intestinale di larve 5 giorni dopo la fecondazione (dpf) per l’analisi del sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq) (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, presentiamo un metodo per l’isolamento e la dissociazione dell’intestino di 5 larve di pesce zebra dpf utilizzando FACS. Con questo metodo, diversi tipi di cellule intestinali sono stati raccolti e analizzati con successo da scRNA-seq, utilizzando la piattaforma 10x Genomics Chromium. Abbiamo selezionato la linea di zebrafish tg(phox2bb:GFP), in quanto volevamo un’indicazione che anche le cellule ENS vitali sarebbero state isolate (Figura 2D). Tuttavia, è importante notare che…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione Amici di Sophia (SSWO WAR-63).
Materials
| 10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) | Sigma | 59418C | |
| 5 mL round bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap | BD Biosciences | 352054 | |
| Cell Ranger v3.0.2 | 10X Genomics | N/A | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | Cat#D-9542 | |
| Dissection microscope | Olympus SZX16 | ||
| FACSAria III sorter machine | BD Biosciences | N/A | |
| HBSS with CaCl2 and MgCl2 | Gibco | 14025050 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| MS-222, Tricaine | Supelco | A5040-250G | |
| Papain | Sigma | P4762 | |
| Seurat v3 | Stuart et al. (2019) | N/A | |
| Trypan blue | Sigma | Cat#T8154 |
Riferimenti
- Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
- Sitrin, M. . The Gastrointestinal System. , (2014).
- Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
- Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
- Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
- Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease – integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
- Antonucci, A., et al. Chronic intestinal pseudo-obstruction. World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).
- De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
- Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
- Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Biologia dello sviluppo. 255 (1), 12-29 (2003).
- Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
- Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
- Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
- Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
- Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
- Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
- Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
- Kline, M. . Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , (2016).
- Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
- Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).
