Summary

Выделение кишечника из личинок данио-рерио для секвенирования одноклеточной РНК

Published: November 10, 2023
doi:

Summary

Здесь мы опишем метод выделения кишечника из личинок данио-рерио через 5 дней после оплодотворения для анализа секвенирования РНК одной клетки.

Abstract

Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) выполняет ряд функций, необходимых для жизни. Врожденные дефекты, влияющие на его развитие, могут привести к нервно-мышечным расстройствам кишечника, что подчеркивает важность понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе развития и дисфункции желудочно-кишечного тракта. В этом исследовании мы представляем метод выделения кишечника из личинок данио-рерио через 5 дней после оплодотворения для получения живых, жизнеспособных клеток, которые могут быть использованы для анализа секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq). Этот протокол основан на ручном рассечении кишечника данио-рерио с последующей ферментативной диссоциацией папаином. Затем клетки подвергают флуоресцентно-активированной клеточной сортировке, а жизнеспособные клетки отбирают для scRNA-seq. С помощью этого метода мы смогли успешно идентифицировать различные типы кишечных клеток, включая эпителиальные, стромальные, кровяные, мышечные и иммунные клетки, а также кишечные нейроны и глию. Поэтому мы считаем его ценным ресурсом для изучения состава желудочно-кишечного тракта в норме и при заболеваниях, используя рыбок данио.

Introduction

Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) — это сложная система, которая играет жизненно важную роль в общем здоровье и благополучии. Он отвечает за переваривание и усвоение питательных веществ, а также за выведение продуктов жизнедеятельности 1,2. Желудочно-кишечный тракт состоит из нескольких типов клеток, включая эпителиальные клетки, гладкомышечные клетки, иммунные клетки и энтеральную нервную систему (ЭНС), которые тесно взаимодействуют друг с другом, регулируя и поддерживая надлежащую функцию кишечника 3,4,5. Дефекты развития желудочно-кишечного тракта могут иметь далеко идущие последствия для различных аспектов, таких как всасывание питательных веществ, состав микробиоты, ось кишечник-мозг и ЭНС, приводя к ряду кишечных нервно-мышечных заболеваний, таких как болезнь Гиршпрунга и хроническая кишечная псевдообструкция 6,7. Эти расстройства характеризуются тяжелой дисмоторикой кишечника, вызванной изменениями в различных ключевых клетках, таких как интерстициальные клетки Кахаля, гладкомышечные клетки и ENS 6,8,9. Тем не менее, молекулярные механизмы, лежащие в основе развития и дисфункции желудочно-кишечного тракта, до сих пор плохо изучены.

Рыбка данио-рерио является ценным модельным организмом для изучения развития и дисфункции желудочно-кишечного тракта благодаря своему быстрому эмбриональному развитию, прозрачности на эмбриональной и личиночной стадиях, а также генетической трактовке 10,11,12,13,14. Существуют многочисленные трансгенные линии данио-рерио, экспрессирующие флуоресцентные белки. Примером такой линии является рыбка данио-рерио tg(phox2bb:GFP), обычно используемая для изучения ЭНС, поскольку все клетки phox2bb+, включая энтеральные нейроны, помечены15,16. Здесь, используя линию данио-рерио tg(phox2bb:GFP), мы представляем метод кишечной изоляции личинок через 5 дней после оплодотворения (dpf) для анализа секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) (рис. 1).

Protocol

Все разведение рыбок данио и эксперименты проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами Erasmus MC и законодательством о благополучии животных. Использование личинок данио-рерио через 5 дней после оплодотворения подпадает под категорию экспериментов, которые н…

Representative Results

С помощью этого протокола мы добились успешной изоляции и диссоциации всего кишечника от 5 личинок dpf. Используя папаин в качестве фермента диссоциации, мы значительно повысили жизнеспособность клеток, позволив зафиксировать 46 139 событий, связанных с одиночными жизнеспособными клетка?…

Discussion

В данной работе мы представляем метод выделения и диссоциации кишечника личинок данио-рерио 5 dpf с использованием FACS. С помощью этого метода различные типы клеток кишечника были успешно собраны и проанализированы с помощью scRNA-seq с использованием платформы 10x Genomics Chromium. Мы выбрали линию ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была профинансирована Фондом друзей Софии (SSWO WAR-63).

Materials

10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%) Sigma 59418C
5 mL round bottom tube with cell-strainer cap Falcon 352235
Agarose Sigma-Aldrich A9539
BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap BD Biosciences 352054
Cell Ranger v3.0.2 10X Genomics N/A
DAPI Sigma-Aldrich Cat#D-9542
Dissection microscope Olympus SZX16
FACSAria III sorter machine BD Biosciences N/A
HBSS with CaCl2 and MgCl2 Gibco 14025050
Insect pins Fine Science Tools 26000-25
L-Cysteine Sigma C7352
MS-222, Tricaine Supelco A5040-250G
Papain Sigma P4762
Seurat v3 Stuart et al. (2019) N/A
Trypan blue  Sigma  Cat#T8154

Riferimenti

  1. Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses. Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).
  2. Sitrin, M. . The Gastrointestinal System. , (2014).
  3. Furness, J. B. The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).
  4. Furness, J. B. The enteric nervous system and neurogastroenterology. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).
  5. Obata, Y., Pachnis, V. The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system. Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).
  6. Heuckeroth, R. O. Hirschsprung disease – integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes. Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).
  7. Antonucci, A., et al. Chronic intestinal pseudo-obstruction. World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).
  8. De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction. Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).
  9. Bianco, F., et al. Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction. Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).
  10. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  11. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
  12. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  13. Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. Intestinal growth and differentiation in zebrafish. Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).
  14. Wallace, K. N., Pack, M. Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish. Biologia dello sviluppo. 255 (1), 12-29 (2003).
  15. Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish. Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).
  16. Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).
  17. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  18. Kuil, L. E., et al. Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level. iScience. 26 (7), 107070 (2023).
  19. Gao, Y., et al. Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver. Cells. 11 (20), 3290 (2022).
  20. Jin, Q., et al. Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification. Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).
  21. Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine. Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).
  22. Kline, M. . Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , (2016).
  23. Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia. Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).
  24. Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres. Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).

Play Video

Citazione di questo articolo
Kakiailatu, N. J. M., Kuil, L. E., Bindels, E., Zink, J. T. M., Vermeulen, M., Melotte, V., Alves, M. M. Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (201), e65876, doi:10.3791/65876 (2023).

View Video