Summary

Frühe ungesteuerte neurovaskuläre Nischenmodellierung des menschlichen Gehirns in die permissive Chorioallantoismembran des Hühnerembryos

Published: February 16, 2024
doi:

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um menschliche Gehirnorganoide in mehreren Reifungsstadien in die Chorioallantoismembran (CAM) des Kükens einzutransplantieren. Gehirnorganoide wurden nach ungesteuerten standardisierten Protokollen gezüchtet.

Abstract

Die Transplantation von Organoiden in vaskularisierte Gewebe von Modelltieren, wie z. B. der immundefizienten Chorioallantoismembran (CAM) von Maus- oder Hühnerembryonen, hat sich für die Modellierung der Neovaskularisation als effizient erwiesen. Die CAM ist eine reich vaskularisierte extraembryonale Membran, die eine begrenzte Immunreaktivität aufweist und somit zu einem hervorragenden Wirtsmodell für Zelltransplantationen menschlichen Ursprungs wird.

Diese Arbeit beschreibt die Strategie, menschliche Gehirnorganoide, die sich in mehreren Reifungsstadien differenziert haben, in die CAM zu transplantieren. Die zelluläre Zusammensetzung von Gehirnorganoiden ändert sich mit der Zeit und spiegelt die Meilensteine der menschlichen Gehirnentwicklung wider. Wir transplantierten Gehirnorganoide in relevanten Reifungsstadien: neuroepitheliale Expansion (18 DIV), frühe Neurogenese (60 DIV) und frühe Gliogenese (180 DIV) in das CAM von embryonalen Tag (E)7 Hühnerembryonen. Transplantierte Hirnorganoide wurden 5 Tage später entnommen und ihre histologischen Merkmale analysiert.

Es wurden keine histologischen Anzeichen einer Neovaskularisation in den transplantierten Organoiden oder abnormalen Blutgefäßen neben den Transplantaten festgestellt. Darüber hinaus wurden bemerkenswerte Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung der transplantierten Organoide beobachtet, nämlich eine Zunahme der Anzahl der sauren Gliaprotein-positiv-reaktiven Astrozyten. Die zytoarchitektonischen Veränderungen waren jedoch vom Organoid-Reifungsstadium abhängig. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Gehirnorganoide in der CAM wachsen können, und sie zeigen Unterschiede in der Zytoarchitektur in Abhängigkeit von ihrem Reifestadium bei der Transplantation.

Introduction

Organoide des menschlichen Gehirns sind eine aufstrebende Technik, die es uns ermöglicht, die frühe Entwicklung des menschlichen Gehirns in vitro zu rekapitulieren 1,2,3. Eine der größten Einschränkungen dieses Modells ist jedoch die fehlende Vaskularisierung, die nicht nur bei der Homöostase des Gehirns, sondern auch bei der Entwicklung des Gehirns eine unverzichtbare Rolle spielt4. Zusätzlich zur Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass das Gefäßsystem des Gehirns die neuronale Differenzierung, Migration und Synaptogenese während der Entwicklung reguliert 5,6. Daher ist es dringend erforderlich, zuverlässige Modelle zu etablieren, die die fehlende vaskuläre Signalübertragung und Struktur für Gehirnorganoide liefern können, was die Komplexität der Generation menschlicher Gehirnorganoideerhöht 7.

Unter den vorgeschlagenen Methoden zur Vaskularisierung können zwei Hauptstromlinien in Betracht gezogen werden: die Organoid-Transplantation in einen lebenden Organismus und reine In-vitro-Technologien zur Kokultivierung von Endothelzellen und Nervenzellen 8,9,10,11,12. Die intrazerebrale Transplantation bei Mäusen ist kostspielig und zeitaufwändig, so dass andere Technologien für einfachere Modelle relevant sind. Der Chick Chorioallantoic Membran (CAM)-Assay wurde ausgiebig zur Untersuchung der Angiogeneseverwendet 13,14,15. In den letzten zehn Jahren haben mehrere Gruppen erfolgreich verschiedene Arten von Organoiden, darunter Nieren16,17, Herz18 und Tumororganoide19,20, in CAMs transplantiert. Dennoch ist wenig über die Wirksamkeit, Toxizität/Abstoßung, physiologische Wirkung und Methoden zur Transplantation menschlicher Gehirnorganoide in die CAM bekannt. Ein weiterer interessanter und noch unerforschter Aspekt ist die Bildung einer chimären Blut-Hirn-Schranke (BHS) zwischen der CAM und der organoiden astrozytischen Grenzfläche. Frühere Pionierarbeiten deuteten auf die mutmaßliche Machbarkeit der Erzeugung einer BHS in der CAM durch Transplantation von Astrozyten und Astrozyten-konditioniertem Mediumhin 21,22,23. Reife Astrozyten scheinen jedoch nicht in der Lage zu sein, dies zu erreichen24,25. Daher bleibt die Astrozyten-induzierte Bildung der BHS umstritten, und die Transplantation menschlicher Gehirnorganoide würde es uns ermöglichen, Licht in diese Kontroverse zu bringen.

Dieser Videoartikel beschreibt ein Protokoll für eine In-Ovo-Organoidtransplantation des menschlichen Gehirns in CAM, die Wachstum, Verbesserung und Vaskularisierung fördert und zu Organoiden führt, die histologisch kompatible BHS-Elemente umfassen. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das das Überleben des Hühnerembryos sicherstellt, und berichten über die Permissivität der CAM zur Aufrechterhaltung des Wachstums von Gehirnorganoiden.

Protocol

Die Embryonen des Weißen Leghornhuhns (Gallus gallus) wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Institute of Laboratory Animals Resources, Commission of Life Sciences, National Research Council, USA, behandelt, und die Experimente wurden vom Council for Care and Use of Experimental Animals der Universität Barcelona genehmigt. 1. Ungesteuerte Präparation von Gehirnorganoiden Halten Sie H9 humane embryonale Stammzellen …

Representative Results

Auswahl des Embryoreifungsplans für die TransplantationDas Experiment beginnt bei D0, wenn befruchtete Eier bei 38 °C und 60 % relativer Luftfeuchtigkeit bebrütet werden. Die Chorioallantoismembran (CAM) ist eine stark vaskularisierte extraembryonale Membran, die sich nach der Inkubation von Eiern entwickelt. Es entsteht durch die Verschmelzung von Allantois und Chorion. Bei D1, nach 24 Stunden Inkubation, wird die Luftkammer punktiert, um zu verhindern, dass sich das CAM an der inneren Schalenmem…

Discussion

In dieser Studie beschreiben wir ein detailliertes Protokoll mit zahlreichen Schlüsselschritten, die ein günstiges Wachstum und eine günstige Entwicklung menschlicher Gehirnorganoide nach der Transplantation ermöglichen, ohne das Überleben der Hühnerembryonen zu beeinträchtigen. Wir empfahlen die Verwendung steriler Nadeln, um die Luftkammer des Eies nach 24 Stunden Inkubation (Tag 1) zu punktieren. Zusätzlich versuchten wir auch, die Punktion an Tag 4 durchzuführen (nachdem wir die Eierschale mit Licht überpr?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Alcántara und Dr. Ortega von der UB und den übrigen Mitgliedern in Dr. Acostas Labor für die aufschlussreichen Diskussionen. S.A. ist Serra-Hunter-Assistenzprofessor an der Generalitat de Catalunya an der Universitat de Barcelona.

Materials

Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse  BioLegend 801201 1:1,000
Anti-GFAP, rabbit GeneTex GTX108711 1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. Invitrogen A-21206 1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat Jackson ImmunoResearch 715-585-150 1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI Invitrogen D1306 1:10,000
DPX Sigma 100579 xylene-based mounting medium 
Gentle Dissociation Solution CreativeBiolabs ITS-0622-YT187 cell dissociation solution
Matrigel BD Biosciences 356234
Mowiol 4-88 mounting media Merk 81381
Paper towel, lab-grade Sigma-Aldrich Z188956
ROCK inhibitor Y27632 Millipore SCM075 10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors VWR 470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides Epredia J1800AMNZ

Riferimenti

  1. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  2. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  3. Yang, Q., Hong, Y., Zhao, T., Song, H., Ming, G. L. What makes organoids good models of human neurogenesis. Front Neurosci. 16, 872794 (2022).
  4. Sun, X. Y., et al. Generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. Elife. 11, e76707 (2022).
  5. Paredes, I., et al. Oligodendrocyte precursor cell specification is regulated by bidirectional neural progenitor-endothelial cell crosstalk. Nat Neurosci. 24 (4), 478-488 (2021).
  6. Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
  7. Apostolou, E., et al. Progress and challenges in stem cell biology. Nat Cell Biol. 25 (2), 203-206 (2023).
  8. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
  9. Cakir, B., et al. Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system. Nat Methods. 16 (11), 1169-1175 (2019).
  10. Shi, Y., et al. Vascularized human cortical organoids (vorganoids) model cortical development in vivo. PLoS Biol. 18 (5), e3000705 (2020).
  11. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nat Biotechnol. 36 (5), 432-441 (2018).
  12. Revah, O., et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 610 (7931), 319-326 (2022).
  13. Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Mol Biol. 843, 47-57 (2012).
  14. Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
  15. Kennedy, D. C., Coen, B., Wheatley, A. M., Mccullagh, K. J. A. Microvascular experimentation in the chick chorioallantoic membrane as a model for screening angiogenic agents including from gene-modified cells. Int J Mol Sci. 23 (1), 452 (2021).
  16. Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat Mater. 18 (4), 397-405 (2019).
  17. Kaisto, S., et al. Optimization of renal organoid and organotypic culture for vascularization, extended development, and improved microscopy imaging. J Vis Exp. (157), e60995 (2020).
  18. Varzideh, F., et al. Human cardiomyocytes undergo enhanced maturation in embryonic stem cell-derived organoid transplants. Biomaterials. 192, 537-550 (2019).
  19. Komatsu, A., et al. The cam model for cic-dux4 sarcoma and its potential use for precision medicine. Cells. 10 (10), 2613 (2021).
  20. Worsdorfer, P., et al. Generation of complex human organoid models including vascular networks by incorporation of mesodermal progenitor cells. Sci Rep. 9 (1), 15663 (2019).
  21. Janzer, R. C., Jaff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325 (6101), 253-257 (1987).
  22. Janzer, R. C. The blood-brain barrier: Cellular basis. J Inherit Metab Dis. 16 (4), 639-647 (1993).
  23. Lobrinus, J. A., Juillerat-Jeanneret, L., Darekar, P., Schlosshauer, B., Janzer, R. C. Induction of the blood-brain barrier specific ht7 and neurothelin epitopes in endothelial cells of the chick chorioallantoic vessels by a soluble factor derived from astrocytes. Brain Res Dev Brain Res. 70 (2), 207-211 (1992).
  24. Holash, J. A., Stewart, P. A. Chorioallantoic membrane (cam) vessels do not respond to blood-brain barrier (bbb) induction. Adv Exp Med Biol. 331, 223-228 (1993).
  25. Holash, J. A., Noden, D. M., Stewart, P. A. Re-evaluating the role of astrocytes in blood-brain barrier induction. Dev Dyn. 197 (1), 14-25 (1993).
  26. Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nat Protoc. 16 (2), 579-602 (2021).
  27. Wagner-Amos, K., Seymour, R. S. Effect of local shell conductance on the vascularisation of the chicken chorioallantoic membrane. Respir Physiol Neurobiol. 134 (2), 155-167 (2003).
  28. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev Dyn. 195 (4), 231-272 (1992).
  29. Paredes, I., Himmels, P., Ruiz De Almodovar, C. Neurovascular communication during cns development. Dev Cell. 45 (1), 10-32 (2018).
  30. Hogan, K. A., Ambler, C. A., Chapman, D. L., Bautch, V. L. The neural tube patterns vessels developmentally using the vegf signaling pathway. Development. 131 (7), 1503-1513 (2004).
  31. Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes control the development of the migration-promoting vasculature scaffold in the postnatal brain via vegf signaling. J Neurosci. 32 (5), 1687-1704 (2012).
  32. Himmels, P., et al. Motor neurons control blood vessel patterning in the developing spinal cord. Nat Commun. 8, 14583 (2017).
  33. Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nat Rev Neurosci. 18 (10), 573-584 (2017).

Play Video

Citazione di questo articolo
Fiore, L., Arderiu, J., Martí-Sarrias, A., Turpín, I., Pareja, R. I., Navarro, A., Holubiec, M., Bianchelli, J., Falzone, T., Spelzini, G., Scicolone, G., Acosta, S. Early Unguided Human Brain Organoid Neurovascular Niche Modeling into the Permissive Chick Embryo Chorioallantoic Membrane. J. Vis. Exp. (204), e65710, doi:10.3791/65710 (2024).

View Video