초기 비유도 인간 뇌 오가노이드 신경 혈관 틈새 모델링을 허용 병아리 배아 맥락막으로 모델링
Summary
여기에서는 여러 성숙 단계에서 인간 뇌 오가노이드를 병아리 융모막(CAM)에 생착하는 프로토콜을 제시합니다. 뇌 오가노이드는 유도되지 않은 표준화된 프로토콜에 따라 성장했습니다.
Abstract
면역 결핍 마우스 또는 병아리 배아 융모막(CAM)과 같은 모델 동물의 혈관 조직에 오가노이드를 생착하는 것은 신생혈관 형성 모델링에 효율적인 것으로 입증되었습니다. CAM은 혈관이 풍부하게 형성된 배아외 막으로, 면역 반응이 제한되어 인간 유래 세포 이식을 위한 훌륭한 호스팅 모델이 되었습니다.
본 논문은 여러 성숙 단계에서 분화된 인간 뇌 오가노이드를 CAM에 이식하는 전략을 설명합니다. 뇌 오가노이드의 세포 구성은 시간이 지남에 따라 변화하며, 이는 인간 뇌 발달의 이정표를 반영합니다. 신경 상피 확장(18 DIV), 초기 신경 발생(60 DIV) 및 초기 신경 형성(180 DIV)과 같은 관련 성숙 단계의 뇌 오가노이드를 배아일(E)7 닭 배아의 CAM에 이식했습니다. 생착된 뇌 오가노이드를 5일 후에 수확하고 조직학적 특징을 분석했습니다.
이식된 오가노이드에서 신생혈관 형성의 조직학적 징후나 이식편에 인접한 비정상적인 혈관은 발견되지 않았습니다. 또한, 이식된 오가노이드의 세포 구성에서 현저한 변화, 즉 신경교세포(glial fibrillary acidic protein-positive-reactive astrocyte)의 수가 증가하는 것이 관찰되었습니다. 그러나 세포구조적 변화는 오가노이드 성숙 단계에 따라 달라졌습니다. 이러한 결과는 뇌 오가노이드가 CAM에서 자랄 수 있음을 시사하며, 이식 시 성숙 단계에 따라 세포 구조의 차이를 보여줍니다.
Introduction
인간 뇌 오가노이드는 인간 뇌의 초기 발달을 in vitro 1,2,3으로 요약할 수 있는 새로운 기술입니다. 그럼에도 불구하고 이 모델의 주요 한계 중 하나는 뇌 항상성뿐만 아니라 뇌 발달에도 필수적인 역할을 하는 혈관화가 부족하다는 것이다4. 축적된 증거에 따르면 산소와 영양소의 전달 외에도 뇌의 혈관계는 발달 과정에서 신경 분화, 이동 및 시냅스 형성을 조절합니다 5,6. 따라서 뇌 오가노이드에 누락된 혈관 신호전달 및 구조를 제공하여 인간 뇌 오가노이드 세대의 복잡성을 높일 수 있는 신뢰할 수 있는 모델 구축이 시급하다7.
제안된 혈관화 방법 중 두 가지 주요 유선형을 고려할 수 있습니다: 살아있는 유기체에 오가노이드 생착과 내피 세포와 신경 세포를 공동 배양하는 순수 시험관 내 기술 8,9,10,11,12. 생쥐의 뇌내 이식은 비용과 시간이 많이 들기 때문에 다른 기술은 더 간단한 모델과 관련이 있습니다. 병아리 융모막 막(CAM) 분석은 혈관신생을 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다 13,14,15. 지난 10년 동안 여러 그룹이 신장 16,17, 심장18 및 종양 오가노이드19,20을 포함한 다양한 유형의 오가노이드를 CAM에 성공적으로 생착했습니다. 그럼에도 불구하고 인간의 뇌 오가노이드를 CAM에 생착시키는 효능, 독성/거부 반응, 생리학적 효과 및 방법에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 또 다른 흥미롭지만 아직 탐구되지 않은 측면은 CAM과 오가노이드 성상세포 인터페이스 사이에 키메라 혈액-뇌 장벽(BBB)이 형성된다는 것입니다. 이전의 선구적인 연구는 성상교세포와 성상교세포가 조건화된 배지를 이식하여 CAM에서 BBB를 생성하는 추정 가능성을 제안했습니다 21,22,23. 그러나 성숙한 성상교세포는 이24,25를 달성할 수 없는 것으로 보인다. 따라서 성상교세포에 의한 BBB의 형성은 여전히 논쟁의 여지가 있으며, 인간 뇌 오가노이드를 이식하면 이 논란에 대한 실마리를 제공할 수 있습니다.
이 비디오 기사는 성장, 개선 및 혈관화를 촉진하여 조직학적으로 호환되는 BBB 요소를 포함하는 오가노이드를 생성하는 CAM으로의 난형 인간 뇌 오가노이드 이식 프로토콜에 대해 설명합니다. 여기에서 우리는 닭 배아의 생존을 보장하는 프로토콜을 제시하고 뇌 오가노이드 성장을 유지하기 위한 CAM의 허용성에 대해 보고합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는 닭 배아의 생존을 방해하지 않으면서 이식 시 인간 뇌 오가노이드의 유리한 성장과 발달을 제공하는 수많은 주요 단계가 포함된 자세한 프로토콜을 설명합니다. 멸균 바늘을 사용하여 배양 24시간(1일) 후 난자의 공기실에 구멍을 뚫을 것을 권장했습니다. 또한, 우리는 또한 4일째에 구멍을 뚫으려고 시도했습니다(건강한 배아에서만 일하고 있는지 확인하기 위해 혈관 발달을 테스?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
통찰력 있는 토론을 해주신 UB의 Alcántara 박사님과 Ortega 박사님, 그리고 Acosta 박사님 연구실의 다른 분들께 감사드립니다. S.A.는 바르셀로나 대학교(Universitat de Barcelona)의 카탈루냐 총대주교(Generalitat de Catalunya)의 세라-헌터(Serra-Hunter) 동료 조교수입니다.
Materials
| Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| Anti-GFAP, rabbit | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| Anti-mouse AlexaFluor 594, goat | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs | Granja Gibert (Cambrils, Spain) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | xylene-based mounting medium |
| Gentle Dissociation Solution | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | cell dissociation solution |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 mounting media | Merk | 81381 | |
| Paper towel, lab-grade | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Sharp-Point Surgical Scissors | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ |
Riferimenti
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