Summary

Fare In Vivo Plasental Hedefli CRISPR Manipülasyonu

Published: April 14, 2023
doi:

Summary

Burada, fare plasentasındaki kritik gelişim yollarını in vivo olarak etkili bir şekilde manipüle etmek için zamana özgü bir yöntem açıklıyoruz. Bu, embriyonik gün 12.5’te CRISPR plazmidlerinin hamile barajların plasentalarına enjeksiyonu ve elektroporasyonu yoluyla gerçekleştirilir.

Abstract

Plasenta, uterodaki memeli gelişimini düzenleyen ve sürdüren önemli bir organdır. Plasenta, anne ve fetüs arasındaki besin maddelerinin ve atıkların transferinden ve büyüme faktörlerinin ve hormonların üretiminden ve verilmesinden sorumludur. Farelerde plasental genetik manipülasyonlar, plasentanın doğum öncesi gelişimdeki spesifik rolünü anlamak için kritik öneme sahiptir. Plasental spesifik Cre eksprese eden transgenik fareler farklı etkinliklere sahiptir ve plasental gen manipülasyonu için diğer yöntemler yararlı alternatifler olabilir. Bu makalede, hedeflenen genlerin ekspresyonunu değiştirmek için kullanılabilecek CRISPR gen manipülasyonunu kullanarak plasental gen ekspresyonunu doğrudan değiştirmek için bir teknik açıklanmaktadır. Nispeten gelişmiş bir cerrahi yaklaşım kullanarak, hamile barajlar embriyonik gün 12.5’te (E12.5) bir laparotomiye tabi tutulur ve bir CRISPR plazmidi bir cam mikropipet tarafından bireysel plasentalara verilir. Plazmid her enjeksiyondan sonra hemen elektropone edilir. Baraj iyileşmesinden sonra, plasentalar ve embriyolar daha sonraki bir zaman noktasında değerlendirilene kadar gelişime devam edebilir. Bu tekniğin kullanımından sonra plasenta ve yavruların değerlendirilmesi, zamana özgü plasenta fonksiyonunun gelişimdeki rolünü belirleyebilir. Bu tür bir manipülasyon, plasenta genetiğinin ve fonksiyonunun çoklu hastalık bağlamlarında fetal büyüme ve gelişimi nasıl etkilediğinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.

Introduction

Plasenta, fetüsün gelişiminde rol oynayan önemli bir organdır. Plasentanın ana rolü, temel faktörleri sağlamak ve besinlerin ve atıkların fetüse ve fetüsten transferini düzenlemektir. Memeli plasentaları, fetal-maternal arayüzü oluşturan hem fetal hem de maternal dokudan oluşur ve bu nedenle hem anne hem de fetüsün genetiği fonksiyon1’i etkiler. Plasentanın genetik anomalileri veya bozulmuş fonksiyonu fetal gelişimi büyük ölçüde değiştirebilir. Önceki çalışmalar, plasenta genetiği ve gelişiminin fetüste spesifik organ sistemlerinin değişmiş gelişimi ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Özellikle, plasentadaki anormallikler fetal beyin, kalp ve vasküler sistemdeki değişikliklerle bağlantılıdır 2,3,4,5.

Hormonların, büyüme faktörlerinin ve diğer moleküllerin plasentadan fetüse taşınması fetal gelişimde önemli bir rol oynar6. Spesifik moleküllerin plasenta üretimini değiştirmenin nörogelişimi değiştirebileceği gösterilmiştir. Maternal inflamasyon, plasentadaki triptofan (TRP) metabolik gen ekspresyonunu değiştirerek serotonin üretimini artırabilir, bu da daha sonra fetal beyinde serotonin birikimi yaratır7. Diğer çalışmalar, kalp kusurlarının yanı sıra plasenta anormallikleri de bulmuştur. Plasentada anormalliklerin, insanlarda en sık görülen doğum kusuru olan konjenital kalp kusurlarına katkıda bulunduğu düşünülmektedir8. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, hem plasentada hem de kalpte benzer hücresel yollara sahip birkaç gen tanımlamıştır. Bozulursa, bu yollar her iki organda da kusurlara neden olabilir9. Plasentadaki kusurlar konjenital kalp kusurlarını şiddetlendirebilir. Plasenta genetiğinin ve fonksiyonunun spesifik fetal organ sistemi gelişimi üzerindeki rolü yeni ortaya çıkan bir çalışma alanıdır.

Fareler hemokoryal plasentalara ve insan plasentalarının diğer özelliklerine sahiptir, bu da onları insan hastalıklarını incelemek için oldukça yararlı modeller haline getirir1. Plasentanın önemine rağmen, şu anda hedefli in vivo genetik manipülasyonların eksikliği vardır. Ayrıca, şu anda nakavtlar veya nakavtlar için plasenta10’daki aşırı ekspresyon veya fonksiyon kazancı manipülasyonlarından daha fazla seçenek bulunmaktadır. Plasentaya özgü manipülasyon için, her biri farklı zaman noktalarında farklı trofoblast soylarında bulunan birkaç transgenik Cre eksprese eden çizgi vardır. Bunlar arasında Cyp19-Cre, Ada / Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER ve Gcm1-Cre11,12,13,14 bulunur. Bu Cre transgenleri verimli olsa da, belirli zaman noktalarında bazı genleri manipüle edemeyebilirler. Plasental gen ekspresyonunu nakavt etmek veya aşırı eksprese etmek için yaygın olarak kullanılan bir diğer yöntem, lentiviral vektörlerin blastosist kültürüne yerleştirilmesidir ve bu da trofoblasta özgü bir genetik manipülasyona neden olur15,16. Bu teknik, gelişimin erken dönemlerinde plasental gen ekspresyonunda sağlam bir değişiklik sağlar. RNA girişiminin in vivo kullanımı plasentada seyrek olarak kullanılmıştır. ShRNA plazmidlerinin yerleştirilmesi, bu makalede açıklanan CRIPSR tekniğine benzer şekilde gerçekleştirilebilir. Bu, plasentadaki PlGF ekspresyonunu başarılı bir şekilde azaltmak için E13.5’te yapılmıştır ve yavru beyin vaskülatürü17 üzerindeki etkileri vardır.

Öncelikle nakavt veya nakavt için kullanılan tekniklere ek olarak, aşırı ekspresyonu indüklemek yaygın olarak adenovirüslerle veya eksojen bir proteinin yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Aşırı ekspresyon için kullanılan teknikler değişen başarı oranlarına sahiptir ve çoğunlukla gebeliğin ilerleyen dönemlerinde uygulanmıştır. İnsülin benzeri büyüme faktörü 1’in (IGF-1) plasenta fonksiyonundaki rolünü araştırmak için, IGF-1 geninin aşırı ekspresyonunu indüklemek için adenoviral aracılı plasental gen transferi yapıldı18,19. Bu, E18.5’te fare gebeliğinin geç dönemlerinde direkt plasenta enjeksiyonu ile gerçekleştirildi. Ek seçenekler sağlamak ve Cre-Lox kombinasyon başarısızlıkları, adenovirüslerin olası toksisitesi ve shRNA’nın hedef dışı etkileri gibi yerleşik plasental genetik manipülasyonların olası başarısızlıklarını atlatmak için, plasentanın in vivo doğrudan CRISPR manipülasyonu kullanılabilir20,21,22. Bu model, aşırı ifade modellerinin eksikliğini gidermek ve esnekliğe sahip bir model oluşturmak için geliştirilmiştir.

Bu teknik, shRNA ve CRISPR plazmidlerinin PlGF ekspresyonunu değiştirmek için doğrudan in vivo fare plasentalarına hedeflendiği Lecuyer ve ark.’nın çalışmalarına dayanmaktadır17. Bu teknik, birden fazla zaman noktasında CRISPR manipülasyonu kullanarak plasenta gen ekspresyonunu doğrudan değiştirmek için kullanılabilir; Bu çalışma için E12.5 seçildi. Plasenta bu noktaya kadar olgunlaşmıştır ve manipüle edilebilecek kadar büyüktür, bu da E12.5 üzerine spesifik bir CRISPR plazmidinin yerleştirilmesine izin verir, bu da gebeliğin ortasından sonuna kadar fetal gelişim üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir23,24. Transgenik yaklaşımlardan farklı olarak, ancak viral indüksiyonlara veya RNA girişimine benzer şekilde, bu teknik, nispeten gelişmiş bir cerrahi yaklaşım kullanarak belirli zaman noktalarında aşırı ekspresyon veya nakavta izin verir, böylece daha önceki değişikliklerden kaynaklanan olası bozulmuş plasentasyon veya embriyonik ölümcüllükten kaçınır. Sadece birkaç plasenta bir çöp içindeki deneysel veya kontrol plazmidini aldığından, yaklaşım iki tür iç kontrole izin verir. Bu kontroller, uygun kontrol plazmidi ile enjekte edilen ve elektropoize edilen ve doğrudan manipülasyon almayan kontrollerdir. Bu teknik, sinerjik aktivasyon aracısı (SAM) CRISPR plazmidi aracılığıyla fare plasentasındaki IGF-1 geninin aşırı ekspresyonunu oluşturmak için optimize edilmiştir. IGF-1 geni seçildi, çünkü IGF-1, doğumdan önce plasentada öncelikle üretilen fetüse verilen önemli bir büyüme hormonudur25,26. Bu yeni plasenta hedefli CRISPR tekniği, plasenta fonksiyonu ile fetal gelişim arasındaki bağlantıyı tanımlamaya yardımcı olmak için doğrudan manipülasyona izin verecektir.

Protocol

Tüm prosedürler federal düzenlemelere ve Iowa Üniversitesi politikasına uygun ve uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Hayvanlar ve hayvancılık Hayvanları yiyecek ve su ad libitum ile 12 saatlik bir gün ışığı döngüsünde tutun. 8-15 haftalık CD-1 dişi fareleri kullanın. E0.5’i tanımlamak için bir çiftleşme fişinin varlığını kullanın. …

Representative Results

Genel prosedür sonuçları (Şekil 6)Çalışmada, manipüle edilmiş üç grup vardı. Bunlar arasında genel bir CRISPR Cas9 kontrol plazmidi (Cas9 Kontrolü), bir aktivasyon kontrolü CRISPR plazmidi (Act Control) veya bir IGF-1 SAM aktivasyon plazmidi (Igf1-OE) ile enjekte edilen plasentalar vardı. Cas9 Kontrolü nakavt plazmidler için daha uygundur ve aktivasyon kontrolü aşırı ekspresyon/aktivasyon plazmidleri için daha uygundur. Pl…

Discussion

Plasenta fetal büyümenin birincil düzenleyicisidir ve daha önce de belirtildiği gibi, plasental gen ekspresyonundaki veya fonksiyonundaki değişiklikler fetal gelişimi önemli ölçüde etkileyebilir6. Burada özetlenen protokol, nispeten gelişmiş bir cerrahi yaklaşım kullanarak fare plasentasının hedefli bir in vivo CRISPR manipülasyonunu gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu teknik, daha ileri çalışmalar için kullanılabilecek canlı embriyoların ve bunlara kar?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar aşağıdaki finansman kaynaklarını kabul etmektedir: R01 MH122435, NIH T32GM008629 ve NIH T32GM145441. Yazarlar, Dr. Val Sheffield ve Dr. Calvin Carter’ın Iowa Üniversitesi’ndeki laboratuvarlarına ameliyathane ve ekipmanlarının kullanımı için ve ayrıca Dr. Eric Van Otterloo, Dr. Nandakumar Narayanan ve Dr. Matthew Weber’e mikroskopi konusundaki yardımları için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Dr. Sara Maurer, Maya Evans ve Sreelekha Kundu’ya pilot ameliyatlardaki yardımları için teşekkür eder.

Materials

1.5 ml Tubes USA Scientific Inc 1615-5500
4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS Thermo Fisher Scientific J61899.AP
96 Well plate Cornings 3598 For BCA kit
Absorbent Underpads Fisher Scientific 14-206-62
Activation Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-437275 Dnase-free water provided for dilution
AMV Reverse Transcriptase New England Biolabs M0277L Use for cDNA synthesis
Anesthetic Gas Vaporizor Vetamac VAD-601TT VAD-compact vaporizer
Artifical Tear Gel Akorn NDC 59399-162-35
BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227 Protein quantification
Biovortexer Bellco Glass, Inc. 198050000 Hand-held tissue homogenizer
CellSens Software Olympus V4.1.1 Image processing to FISH images.
Centrifuge 5810 Eppendorf EP022628168 Plate centrifuge
Chloroform Thermo Fisher Scientific J67241-AP RNA isolation
Cotton Tipped Applicators ProAdvantage 77100 Sterilize before use
CRISPR/Cas9 Control Plasmid Santa Cruz Biotechnology sc-418922 Dnase-free water provided for dilution
CryoStat Leica CM1950
Dissection Microscope Leica M125 C Used for post-necroscopy imaging
Dissolvable Sutures Med Vet International J385H
Distilled Water Gibco 15230162
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Thermo fisher Scientific 14190144 (-) Calcium; (-) Magnesium
ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0662 Generator only
Electric Razor Wahl CL9990 Kent Scientific
Electroporation paddles/Tweezertrodes BTX Harvard Apparatus 45-0487 3 mm diameter paddles; wires included
Embedding Cassette: 250 PK Grainger 21RK94 Placenta embedding cassettes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 268280010
F-Air Canisters Penn Veterinary Supply Inc BIC80120 Excess isoflurane filter
Fast Green Dye FCF Sigma F7252-5G Dissolve to 1 μg/ml and filter; protect from light
Filter-based microplate photometer (plate reader) Fisher Scientific 14377576 Can be used for BCA and ELISA
Forceps VWR 82027-386 Fine tips, straight, serrated
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma Aldrich HT501128
Glass Capillaries – Borosilicate Glass (Micropipette) Sutter Instrument B150-86-10 O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length
Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x) Thermo Scientific 1861281 Protein homogenization buffer
Heating Pad Thermotech S766D Digitial Moist Heating Pad
Hemostats VWR 10806-188 Fully surrated jaw; curved
Hot Water Bath Fisher Scientific 20253 Isotemp 205
Igf-1 SAM Plasmid (m1) Santa Cruz Biotechnology sc-421056-ACT Dnase-free water provided for dilution
Induction Chamber Vetamac 941443 No specific liter size required
Isoflurane Piramal Pharma Limited NDC 66794-013-25
Isoproponal/2-Proponal Fisher Scientific A451-4 RNA isolation
Ketamine HCl 100mg/ml Akorn NDC 59399-114-10
MgCl2/Magneisum Chloride Sigma Aldrich 63069-100ML 1M. Protein homogenization buffer
MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Fisher Scientific 4309849 Barcoded plates not required
Microcapillary Tip Eppendorf 5196082001 Attached to BTX Microinjector
Microinjector BTX Harvard Apparatus 45-0766 Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes
Microject 1000A (Injection Machine) BTX Harvard Apparatus 45-0751 MicroJect 1000A Plus System
Micropipette Puller Model P-97 Sutter Instrument P-97 Flaming/Brown type micropipette puller
Microplate Mixer (Plate Shaker) scilogex 822000049999
Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit R & D Systems MG100
Needles BD – Becton, Dickson, and Company 305106 30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)
Nitrogen Tank Linde 7727-37-9 Any innert gas
Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID) Norbrook Laboratories Limited NDC 55529-040-10 Analesgic such as Meloxicam
Nose Cone Vetamac 921609 9-14 mm
Opal 620 detection dye Akoya Biosciences SKU FP1495001KT Used for FISH
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound Sakura 4583
Oxygen Tank Linde 7782 – 44 – 7 Medical grade oxygen
Pestles USA Scientific Inc 14155390
Povidone-Iodine Solution, 5% Avrio Health L.P. NDC 67618-155-16
Power SYBR™ Green PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4367659 Use for qPCR
Random Hexamers (Random Primers) New England Biolabs S1330S Use for cDNA synthesis
Razor Blade Grainger 26X080
RNA Cleanup Kit & Concentrator Zymo Research R1013
RNALater Thermo Fisher Scientific AM7021
RNAscope kit v.2.5 Advanced Cells Diagnostics 323100 Contains all reagents required for fluorescent in situ hybridization. Probes sold separately.
RNAscope™ Probe- Mm-Prl8a8-C2 Advanced Cells Diagnostics  528641-C2
RNAscope™ Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 Advanced Cells Diagnostics 527421
Roto-Therm Mini Benchmark R2020 Dry oven for in situ hybridization
Scissors VWR 82027-578 Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4¹/₂
Sodium Chloride (Saline) Hospra NDC 0409-4888-03 Sterile,  0.9%
Sodium Citrate, Trisodium Salt, Dihydrate, [Citric Acid, Trisodium Dihydrate] Research Product International 03-04-6132
Sodium Hydroxide 1N Concentrate, Fisher Chemical Fisher Scientific SS277 Protein homogenization buffer
Steamer Bella B00DPX8UBA
Sterile Surgical Drape Busse 696 Sterilize before use
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Surgipath Cover Glass 24×60 Leica 3800160
Syringes BD – Becton, Dickson, and Company 309659 BD Luer Slip Tip Syringe sterile, single use, 1 mL
Thermo Scientific™ Invitrogen™ Nanodrop™ One Spectrophotometer with WiFi and Qubit™ 4 Fluorometer Fisher Scientific 13-400-525 This configuration comes with Qubit 4 fluorometer.  Qubit quantification not required.
Tissue Adhesive 3M 1469SB VetBond
Tris HCl Thermo Fisher Scientific 15568025 1M. Protein homogenization buffer
TRIzol™ Reagent Thermo Fisher Scientific 15596018 RNA isolation
TSA Buffer Pack Advanced Cells Diagnostics 322810 Used to dilute Opal 620 detection dye
Universal F-Circuit Vetamac 40200 Attached to vaporizer and vaporizer accessories
Upright Compound Fluorescence Microscope Olympus BX61VS Used for FISH imaging
Vectorshield with DAPI Vector Laboratories H-1200 Coverslip mounting media
ViiA™ 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block Thermo Fisher Scientific 4453536 This is for SYBR 384-well block detection.  TaqMan and/or smaller blocks available
Wet n Wild Nail Polish Wild Shine, Clear Nail Protector, Nail Color Amazon C450B
Xylazine 20mg/ml Anased 343730_RX

Riferimenti

  1. Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
  2. Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
  3. Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
  4. Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735 (2018).
  5. Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230 (2021).
  6. Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570 (2018).
  7. Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
  8. vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
  9. Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756 (2022).
  10. Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
  11. Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
  12. Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236 (2012).
  13. Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
  14. Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
  15. Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652 (2017).
  16. Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
  17. Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44 (2017).
  18. Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632 (2013).
  19. Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
  20. Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
  21. Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
  22. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
  23. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  24. Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
  25. Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
  26. Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
  27. Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653 (2012).
  28. Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
  29. Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
  30. Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
  31. Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
  32. Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
  33. Nakamura, H. . Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , (2009).
  34. Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909 (2020).
  35. Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
  36. Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202 (2012).
  37. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  38. Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
  39. Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118 (2021).
  40. Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
  41. Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).

Play Video

Citazione di questo articolo
Carver, A. J., Taylor, R. J., Stevens, H. E. Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation. J. Vis. Exp. (194), e64760, doi:10.3791/64760 (2023).

View Video