Muis in vivo placenta-gerichte CRISPR-manipulatie

De placenta is een essentieel orgaan dat betrokken is bij de ontwikkeling van de foetus. De belangrijkste rol van de placenta is om essentiële factoren te bieden en de overdracht van voedingsstoffen en afval van en naar de foetus te reguleren. Zoogdier placenta’s zijn samengesteld uit zowel foetaal als maternaal weefsel, die de foetale-maternale interface vormen, en dus de genetica van zowel de moeder als de foetus beïnvloeden functie¹. Genetische afwijkingen of verminderde functie van de placenta kunnen de foetale ontwikkeling drastisch veranderen. Eerder werk heeft aangetoond dat placentale genetica en ontwikkeling geassocieerd zijn met de veranderde ontwikkeling van specifieke orgaansystemen bij de foetus. Met name afwijkingen in de placenta zijn gekoppeld aan veranderingen in de foetale hersenen, het hart en het vasculaire systeem 2,3,4,5.

Het transport van hormonen, groeifactoren en andere moleculen van de placenta naar de foetus speelt een belangrijke rol in de foetale ontwikkeling⁶. Het is aangetoond dat het veranderen van de placentaproductie van specifieke moleculen de neurologische ontwikkeling kan veranderen. Maternale ontsteking kan de productie van serotonine verhogen door de metabole genexpressie van tryptofaan (TRP) in de placenta te veranderen, wat vervolgens een accumulatie van serotonine in de foetale hersenen creëert⁷. Andere studies hebben placenta-afwijkingen gevonden naast hartafwijkingen. Afwijkingen in de placenta worden verondersteld bij te dragen aan aangeboren hartafwijkingen, de meest voorkomende geboorteafwijking bij mensen⁸. Een recente studie heeft verschillende genen geïdentificeerd die vergelijkbare cellulaire routes hebben in zowel de placenta als het hart. Indien verstoord, kunnen deze paden defecten in beide organen veroorzaken⁹. De defecten in de placenta kunnen aangeboren hartafwijkingen verergeren. De rol van placentale genetica en functie op de ontwikkeling van specifieke foetale orgaansystemen is een opkomend vakgebied.

Muizen hebben hemochoriale placenta’s en andere kenmerken van menselijke placenta’s, waardoor ze zeer nuttige modellen zijn voor het bestuderen van menselijke ziekten¹. Ondanks het belang van de placenta is er momenteel een gebrek aan gerichte in vivo genetische manipulaties. Bovendien zijn er momenteel meer opties beschikbaar voor knock-outs of knockdowns dan overexpressie of gain-of-function-manipulaties in de placenta¹⁰. Er zijn verschillende transgene Cre-expressing lijnen voor placenta-specifieke manipulatie, elk in verschillende trofoblastlijnen op verschillende tijdstippen. Deze omvatten Cyp19-Cre, Ada / Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER en Gcm1-Cre 11,12,13,14. Hoewel deze Cre-transgenen efficiënt zijn, zijn ze mogelijk niet in staat om sommige genen op specifieke tijdstippen te manipuleren. Een andere veelgebruikte methode om placentale genexpressie uit te schakelen of te overexpresseren is het inbrengen van lentivirale vectoren in de blastocystcultuur, die een trofoblastspecifieke genetische manipulatie veroorzaakt^15,16. Deze techniek zorgt voor een robuuste verandering in de placenta-genexpressie vroeg in de ontwikkeling. Het gebruik van RNA-interferentie in vivo is schaars gebruikt in de placenta. Het inbrengen van shRNA-plasmiden kan op dezelfde manier worden uitgevoerd als de CRIPSR-techniek die in dit artikel wordt beschreven. Dit is gedaan bij E13.5 om met succes de PlGF-expressie in de placenta te verminderen, met gevolgen voor de hersenvasculatuur^{van nakomelingen 17}.

Naast technieken die voornamelijk worden gebruikt voor knock-out of knockdown, wordt het induceren van overexpressie vaak uitgevoerd met adenovirussen of het inbrengen van een exogene eiwit. De technieken die worden gebruikt voor overexpressie hebben verschillende succespercentages en zijn meestal later in de zwangerschap uitgevoerd. Om de rol van insuline-achtige groeifactor 1 (IGF-1) in de placentafunctie te onderzoeken, werd een adenoviraal-gemedieerde placentale genoverdracht uitgevoerd om de overexpressie van het IGF-1-gen ^18,19 te induceren. Dit werd laat in de dracht van de muis uitgevoerd op E18,5 via directe placenta-injectie. Om extra opties te bieden en mogelijke mislukkingen van gevestigde placentale genetische manipulaties te omzeilen, zoals Cre-Lox-combinatiefouten, de mogelijke toxiciteit van adenovirussen en de off-target effecten van shRNA, kan in vivo directe CRISPR-manipulatie van de placenta worden gebruikt^20,21,22. Dit model is ontwikkeld om het gebrek aan overexpressiemodellen aan te pakken en een model met flexibiliteit te creëren.

Deze techniek is gebaseerd op het werk van Lecuyer et al., waarin shRNA- en CRISPR-plasmiden in vivo direct op muis-placenta’s werden gericht om de PlGF-expressie te veranderen¹⁷. Deze techniek kan worden gebruikt om placentale genexpressie direct te veranderen met behulp van CRISPR-manipulatie op meerdere tijdstippen; voor dit werk is gekozen voor E12.5. De placenta is op dit punt gerijpt en is groot genoeg om te manipuleren, waardoor een specifiek CRISPR-plasmide op E12.5 kan worden ingebracht, wat een aanzienlijke invloed kan hebben op de foetale ontwikkeling van midden tot laat in de zwangerschap^23,24. In tegenstelling tot transgene benaderingen, maar vergelijkbaar met virale inducties of RNA-interferentie, maakt deze techniek overexpressie of knock-out op bepaalde tijdstippen mogelijk met behulp van een relatief geavanceerde chirurgische aanpak, waardoor mogelijke verminderde placentatie of embryonale letaliteit van eerdere veranderingen wordt vermeden. Omdat slechts enkele placenta’s het experimentele of controleplasmide in een nest ontvangen, maakt de aanpak twee soorten interne controles mogelijk. Deze controles zijn die geïnjecteerd en geëlektropoeerd met het juiste controleplasmide en die geen directe manipulatie ontvangen. Deze techniek werd geoptimaliseerd om een overexpressie van het IGF-1-gen in de placenta van de muis te creëren via een synergetische activeringsmediator (SAM) CRISPR-plasmide. Het IGF-1-gen werd gekozen, omdat IGF-1 een essentieel groeihormoon is dat aan de foetus wordt afgegeven en dat voornamelijk vóór de geboorte in de placenta wordt geproduceerd^25,26. Deze nieuwe placenta-gerichte CRISPR-techniek maakt directe manipulatie mogelijk om het verband tussen de placentafunctie en de foetale ontwikkeling te helpen definiëren.