Summary

マウス胎児の構造的心臓欠損を特徴付けるパイプライン

Published: December 16, 2022
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Summary

この記事では、胎児心エコー検査、剖検、およびエピスコピック共焦点顕微鏡(ECM)を使用したエピスコピック蛍光画像キャプチャ(EFIC)を使用したマウス先天性心疾患(CHD)診断方法とそれに続く3次元(3D)再構成について詳しく説明します。

Abstract

先天性心疾患(CHD)は、米国における乳児死亡の主な原因です。1980年代以前には、中等度または重度のCHDのほとんどの患者は成人期前に死亡し、生後1週間で最大の死亡率を示しました。外科的技術、診断アプローチ、および医学的管理の目覚ましい進歩により、転帰は著しく改善されました。先天性心疾患を理解するという重要な研究ニーズに対応するために、マウスモデルは人間と心臓の解剖学的構造が非常に似ており、妊娠率が短いため、理想的な研究プラットフォームを提供してきました。遺伝子工学とハイスループット表現型ツールの組み合わせにより、構造的な心臓欠陥の複製と診断が可能になり、CHDの背後にある分子経路をさらに解明することができました。非侵襲的胎児心エコー検査を使用してマウスモデルの心臓表現型をスクリーニングし、エピスコピック共焦点顕微鏡(ECM)組織病理学と3次元(3D)再構成を使用したエピスコピック蛍光画像キャプチャ(EFIC)の高忠実度を組み合わせることで、さまざまな先天性心疾患の解剖学的構造を詳細に見ることができます。このプロトコルは、マウス先天性心疾患の正確な診断を得るためのこれらの方法の完全なワークフローを概説しています。この表現型プロトコルをモデル生物に適用することで、正確なCHD診断が可能になり、CHDのメカニズムに関する洞察が得られます。CHDの根底にあるメカニズムを特定することは、潜在的な治療法と介入の機会を提供します。

Introduction

先天性心疾患(CHD)は最も一般的な新生児先天性欠損症1,2であり、新生児の約0.8%〜1.7%に影響を及ぼし、重大な新生児死亡率と罹患率をもたらします3。遺伝的病因はCHD4,5で強く示されています。遺伝子改変マウスモデルは、マウスとヒトの胎児において4腔心臓と同等の心臓発達DNA配列を有するマウスに起因するCHDの複雑さとそれらを引き起こすメカニズムを理解するために広く使用されてきた6。マウス変異体の表現型を特定することは、標的遺伝子の機能を特徴付けるための基本的な最初のステップです。単一の遺伝子変異がヒトCHDを模倣する心臓欠陥のスペクトルをもたらす可能性がある遺伝子投与量効果を発現するマウスモデルは、CHDの複雑さとそれらを引き起こすメカニズムを理解するために重要です。

この記事では、マウスモデルにおける心臓表現型を特徴付けるためのパイプラインの概要を説明します。適用された方法は、胎児心エコー図7、続いて剖検およびECM組織病理学7,8を利用し、発達中のマウス心臓表現型の詳細な解剖学的構造を表示できます。胎児心エコー図は、合理的な画像解像度で複数の胚を直接視覚化できる非侵襲的なモダリティです。さらに、胎児心エコー図は、同腹仔の胚の総数、それらの発達段階、および子宮角の相対的な向きと位置を迅速に決定します。スペクトルドップラー/カラーフローを使用して、構造、血行動態障害、成長制限、または水腫の発生に基づいて異常な胚を特定できます。胎児心エコー図検査は非侵襲的な技術であるため、数日間スキャンし、血行動態や心臓形態の変化を観察するために使用できます。胎児心エコー図の高品質な画像を取得するには、経験と知識が不足しているために特定の心臓の欠陥が見逃される可能性があるため、練習とスキルが必要です。このため、剖検とECM組織病理学の組み合わせにより、心臓形態のより明確な分析が得られる可能性があります。剖検は、アーチ構造、大動脈と肺動脈の相対的な関係、心室と心房のサイズ、胸部に対する心臓の位置、および気管支肺構造を直接視覚化します。ただし、心臓弁や壁の厚さなどの内部の特徴は、剖検だけでは評価が難しい場合があります。したがって、ECM組織病理学は決定的な診断に推奨されます。ECM組織病理学は、画像スタック9の2Dおよび3D再構成の両方を可能にする高解像度の視覚化技術である。これらの画像は、パラフィン包埋サンプルを自動ミクロトームによって一定の間隔で薄く切片化した連続エピスコピック蛍光イメージングによって得られます。古典的な組織学とは異なり、画像はブロックから切り取られる前にセクションとしてキャプチャされ、すべての画像が同じ参照フレーム内でキャプチャされます。このため、ECM組織病理学によって生成された2D画像スタックは、容易かつ確実に3次元で再構築することができます。これは、DICOMビューアを使用して行われ、コロナ、矢状、横の3つの解剖学的平面の画像を3D視覚化できます。これらの高解像度3D再構成から、決定的な心臓診断が行われる可能性があります。これら3つの異なる視覚化モダリティを個別または組み合わせて適用することで、マウス胚の構造的心臓欠陥の正確な特性評価を提供できます。

Protocol

マウスはヒトCHDを模倣できる4室の心臓を持っているため、これらの研究にマウスを使用する必要があります。 マウスは獣医ケアを受け、施設の実験動物管理評価認定協会(AAALAC)認定の動物飼育施設に収容されました。マウスの不快感、ストレス、痛み、および怪我を最小限に抑えるために、厳格なプロトコルに従いました。マウスは、安楽死に関する米国獣医師会ガイドラインに従って小型…

Representative Results

重大な血行動態障害を有するマウス胚は、胚致死であることが指摘された。さまざまなビューを使用した高出力の非侵襲的胎児心エコー図により、さまざまなCHDを特定できます(図1)。 中隔欠損症:最も一般的なCHDは、心室中隔欠損症(VSD)、房室中隔欠損症(AVSD)、心房中隔欠損症(ASD)などの中隔欠損症です1。VSDまたはAVSD?…

Discussion

遺伝子改変マウスは、先天性心疾患の病態メカニズムを理解するために使用されています。この研究で提供するプロトコルは、マウス胎児の心臓の欠陥を評価するプロセスを合理化および標準化しようとしています。ただし、プロトコル中に注意すべき重要な手順があります。マウスの胚は妊娠の各日に有意に成長し、胎児の心エコー図を正確に行うことでマウスを採取する正確な時期を決?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

何一つ。

Materials

1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 Sigma Aldrich P3813
1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) SealRite 1615-5599
10% buffered formalin phosphate solution Fisher Chemical SF100-4
100% Ethanol Decon Laboratories 2701
16% paraformaldehyde (PFA) fixative  ThermoScientific 28908 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C
50 mL tubes Falcon 352070
6–12 Well plate or 20 mL vial  for embryo storage Falcon 353046
Dissecting microscope  Leica MDG36
Dissecting Pins (A1 or A2 grade) F.S.T 26002-15
Dissecting Plate  F.S.T FB0875713 Petri dish with paraffin base
Embedding molds Sakura 4133
Extra narrow scissors (10.5 cm) F.S.T 14088-10 1–2 pairs 
Fiji application/Image J NIH Fiji.sc
Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) F.S.T 11252-00 2 Pairs
Hot forceps  F.S.T 11252-00 For orientation of embryos
Industrial Marker for Wax Blocks  Sharpie 2003898 Formatted for labratory use
Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera  Jenoptik 017953-650-26
Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software Jenoptik jenoptik.com
Large glass beaker  Fisher Scientific S111053 For melting paraffin
Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) Leica M165 FC
OsiriX MD Version 12.0 OsiriX osirix-viewer.com 
Paraplast embedding paraffin wax Millipore Sigma 1003230215
Small glass beaker Fisher Scientific S111045
Small, perforated spoon (14.5 cm) F.S.T 10370-17
Straight Vannas Scissors (4–8 mm) F.S.T 15018-10 A pair
Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope FUJIFILM VisualSonics Inc. Vevo2100
Xylene Fisher Chemical UN1307

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Guzman-Moreno, C., Zhang, P., Phillips, O. R., Block, M., Glennon, B. J., Holbrook, M., Weigand, L., Lo, C. W., Lin, J. I. A Pipeline to Characterize Structural Heart Defects in the Fetal Mouse. J. Vis. Exp. (190), e64582, doi:10.3791/64582 (2022).

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