Summary

Una pipeline per caratterizzare i difetti cardiaci strutturali nel topo fetale

Published: December 16, 2022
doi:

Summary

Questo articolo descrive in dettaglio i metodi diagnostici di cardiopatia congenita murina (CHD) utilizzando l’ecocardiografia fetale, la necroscopia e l’acquisizione di immagini a fluorescenza episcopica (EFIC) utilizzando la microscopia confocale episcopica (ECM) seguita da ricostruzione tridimensionale (3D).

Abstract

Le malattie cardiache congenite (CHD) sono le principali cause di morte infantile negli Stati Uniti. Nel 1980 e prima, la maggior parte dei pazienti con CHD moderata o grave è morta prima dell’età adulta, con la massima mortalità durante la prima settimana di vita. Notevoli progressi nelle tecniche chirurgiche, negli approcci diagnostici e nella gestione medica hanno portato a notevoli miglioramenti nei risultati. Per affrontare le esigenze di ricerca critiche per comprendere i difetti cardiaci congeniti, i modelli murini hanno fornito una piattaforma di ricerca ideale, in quanto hanno un’anatomia cardiaca molto simile agli esseri umani e brevi tassi di gestazione. La combinazione di ingegneria genetica con strumenti di fenotipizzazione ad alto rendimento ha permesso la replicazione e la diagnosi di difetti cardiaci strutturali per chiarire ulteriormente i percorsi molecolari alla base delle malattie coronariche di CHD. L’uso dell’ecocardiografia fetale non invasiva per lo screening dei fenotipi cardiaci nei modelli murini insieme all’alta fedeltà dell’acquisizione di immagini a fluorescenza episcopica (EFIC) utilizzando l’istopatologia della microscopia confocale episcopica (ECM) con ricostruzioni tridimensionali (3D) consente una visione dettagliata dell’anatomia di vari difetti cardiaci congeniti. Questo protocollo delinea un flusso di lavoro completo di questi metodi per ottenere una diagnosi accurata dei difetti cardiaci congeniti murini. L’applicazione di questo protocollo di fenotipizzazione agli organismi modello consentirà una diagnosi accurata di CHD, fornendo informazioni sui meccanismi della CHD. Identificare i meccanismi alla base della CHD offre opportunità per potenziali terapie e interventi.

Introduction

Le cardiopatie congenite (CHD) sono il difetto alla nascita neonatale più comune 1,2, che colpisce circa lo 0,8%-1,7% dei neonati e provoca una significativa mortalità e morbilità neonatale3. Un’eziologia genetica è fortemente indicata con CHDs 4,5. I modelli murini geneticamente modificati sono stati ampiamente utilizzati per comprendere la complessità delle malattie coronariche e i meccanismi che le causano a causa dei topi con cuori a quattro camere e sequenze di DNA dello sviluppo cardiaco comparabili nei feti di topo e umani6. L’identificazione del fenotipo dei mutanti murini è il primo passo fondamentale per caratterizzare la funzione del gene bersaglio. I modelli murini che esprimono effetti di dosaggio genico, in cui una singola mutazione genetica può provocare uno spettro di difetti cardiaci che imitano i CHD umani, sono importanti per comprendere la complessità dei CHD e i meccanismi che li causano.

Questo articolo delinea una pipeline per caratterizzare i fenotipi cardiaci nei modelli murini. I metodi applicati utilizzano l’ecocardiogramma fetale 7, seguito da necroscopia e istopatologia ECM 7,8, che può visualizzare l’anatomia dettagliata dello sviluppo di fenotipi cardiaci murini. Un ecocardiogramma fetale è una modalità non invasiva che consente la visualizzazione diretta di più embrioni con una risoluzione di imaging ragionevole. Inoltre, un ecocardiogramma fetale fornisce una rapida determinazione del numero totale di embrioni in una cucciolata, delle loro fasi di sviluppo e del relativo orientamento e posizione nel corno uterino. Utilizzando un Doppler spettrale / flusso di colore, gli embrioni anomali possono essere identificati in base alla struttura, al disturbo emodinamico, alla restrizione della crescita o allo sviluppo di idrope. Poiché uno studio ecocardiogramma fetale è una tecnica non invasiva, può essere utilizzato per eseguire scansioni su più giorni e per osservare i cambiamenti nell’emodinamica o nella morfologia cardiaca. Ottenere immagini di alta qualità degli ecocardiogrammi fetali richiede pratica e abilità, poiché specifici difetti cardiaci possono essere persi a causa della mancanza di esperienza e conoscenza. Per questo motivo, un’analisi più definitiva della morfologia cardiaca può essere ottenuta attraverso una combinazione di necroscopia e istopatologia ECM. La necroscopia fornisce la visualizzazione diretta della struttura dell’arco, delle relazioni relative dell’aorta e dell’arteria polmonare, della dimensione dei ventricoli e degli atri, della posizione del cuore rispetto al torace e delle strutture broncopolmonari. Tuttavia, le caratteristiche interne come le valvole cardiache e lo spessore della parete possono essere difficili da valutare attraverso la sola necroscopia. Pertanto, l’istopatologia ECM è raccomandata per una diagnosi conclusiva. L’istopatologia ECM è una tecnica di visualizzazione ad alta risoluzione che consente la ricostruzione sia 2D che 3D dello stack di immagini9. Queste immagini sono ottenute attraverso l’imaging fluorescente episcopico seriale di un campione incorporato in paraffina poiché è sezionato sottilmente ad un intervallo costante da un microtomo automatico. A differenza dell’istologia classica, le immagini vengono catturate come una sezione prima di essere tagliate dal blocco in modo tale che tutte le immagini siano catturate all’interno dello stesso sistema di riferimento. Per questo motivo, lo stack di immagini 2D prodotto dall’istopatologia ECM può essere facilmente e in modo affidabile ricostruito in tre dimensioni. Questo viene fatto utilizzando un visualizzatore DICOM, che consente la visualizzazione 3D delle immagini nei tre piani anatomici: coronale, sagittale e trasversale. Da queste ricostruzioni 3D ad alta risoluzione, può essere fatta una diagnosi cardiaca definitiva. L’applicazione di queste tre diverse modalità di visualizzazione, singolarmente o in combinazione, può fornire caratterizzazioni accurate dei difetti cardiaci strutturali negli embrioni di topo.

Protocol

L’uso di topi per questi studi è necessario in quanto i topi hanno cuori a quattro camere che possono imitare i CHD umani. I topi sono stati forniti di cure veterinarie e ospitati nella struttura accreditata per la cura degli animali da laboratorio dell’Associazione per la valutazione e l’accreditamento della cura degli animali da laboratorio (AAALAC). Sono stati seguiti protocolli rigorosi per ridurre al minimo il disagio, lo stress, il dolore e le lesioni dei topi. I topi sono stati eutanizzati usando gas CO2</su…

Representative Results

Gli embrioni di topo con difetti emodinamici significativi sono stati notati per essere letali embrionali. Un’ampia varietà di CHD può essere identificata attraverso l’ecocardiogramma fetale non invasivo ad alto rendimento utilizzando diverse viste (Figura 1). Difetti del setto: I CHD più comuni sono difetti del setto come un difetto del setto ventricolare (VSD), un difetto del setto atrioventricolare (AVSD) e un difetto del setto atriale (ASD)…

Discussion

Topi geneticamente modificati sono stati utilizzati per comprendere i meccanismi patologici dei difetti cardiaci congeniti. I protocolli che forniamo in questo studio tentano di semplificare e standardizzare il processo di valutazione dei difetti cardiaci fetali murina. Tuttavia, ci sono passaggi critici da notare durante il protocollo. Gli embrioni di topo crescono in modo significativo durante ogni giorno di gestazione e il momento corretto per raccogliere un topo può essere determinato eseguendo accuratamente un ecoc…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nessuno.

Materials

1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 Sigma Aldrich P3813
1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) SealRite 1615-5599
10% buffered formalin phosphate solution Fisher Chemical SF100-4
100% Ethanol Decon Laboratories 2701
16% paraformaldehyde (PFA) fixative  ThermoScientific 28908 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C
50 mL tubes Falcon 352070
6–12 Well plate or 20 mL vial  for embryo storage Falcon 353046
Dissecting microscope  Leica MDG36
Dissecting Pins (A1 or A2 grade) F.S.T 26002-15
Dissecting Plate  F.S.T FB0875713 Petri dish with paraffin base
Embedding molds Sakura 4133
Extra narrow scissors (10.5 cm) F.S.T 14088-10 1–2 pairs 
Fiji application/Image J NIH Fiji.sc
Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) F.S.T 11252-00 2 Pairs
Hot forceps  F.S.T 11252-00 For orientation of embryos
Industrial Marker for Wax Blocks  Sharpie 2003898 Formatted for labratory use
Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera  Jenoptik 017953-650-26
Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software Jenoptik jenoptik.com
Large glass beaker  Fisher Scientific S111053 For melting paraffin
Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) Leica M165 FC
OsiriX MD Version 12.0 OsiriX osirix-viewer.com 
Paraplast embedding paraffin wax Millipore Sigma 1003230215
Small glass beaker Fisher Scientific S111045
Small, perforated spoon (14.5 cm) F.S.T 10370-17
Straight Vannas Scissors (4–8 mm) F.S.T 15018-10 A pair
Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope FUJIFILM VisualSonics Inc. Vevo2100
Xylene Fisher Chemical UN1307

Riferimenti

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  2. vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
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Citazione di questo articolo
Guzman-Moreno, C., Zhang, P., Phillips, O. R., Block, M., Glennon, B. J., Holbrook, M., Weigand, L., Lo, C. W., Lin, J. I. A Pipeline to Characterize Structural Heart Defects in the Fetal Mouse. J. Vis. Exp. (190), e64582, doi:10.3791/64582 (2022).

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