Flödescytometribaserad kvantifiering och analys av myokardiella B-celler

B-lymfocyter är högspecialiserade immunceller som spelar en viktig roll i både adaptiva och medfödda immunsvar¹. Det finns två huvudpopulationer av B-celler: en mindre population av B1-celler som mestadels produceras under embryonalt liv och en övervägande population av B2-celler som produceras i vuxenlivet i benmärgen¹. Efter mognad i benmärgen migrerar B-celler till primära och sekundära lymfoida organ. Därifrån återcirkulerar de kontinuerligt mellan lymfoida organ som färdas genom blodkärl och lymfkärl². B-celler uttrycker specifika antikroppar på deras yta, som fungerar som receptorer. När B-celler stöter på ett antigen som binder till deras receptor kan en aktiverande signal utlösas. Aktiverade B-celler migrerar antingen till vävnaden där antigenet hittades eller går tillbaka till benmärgen där de kan mogna till antikroppsproducerande plasmaceller ^3,4.

Nyligen har det uppskattats att hjärtat har en stor population av B-celler. Studier på gnagare har visat att B-celler koloniserar hjärtat tidigt under embryonal utveckling⁵, och att myokardassocierade B-celler mestadels är intravaskulära, naiva B2-celler vidhäftade till endotelet^6,7, med en liten andel B1-celler ⁷. Det finns fortfarande många osäkerhetsområden, men tillgängliga data indikerar att B-celler spelar en viktig roll både i det naiva hjärtat och i samband med myokardiell anpassning till skada.

Studier i det naiva murina hjärtat har visat att vid baslinjen är myokardiella B-celler mestadels belägna i det intravaskulära utrymmet, vidhäftade till endotelet (>95% av murina hjärt-B-celler befanns vara belägna i det intravaskulära utrymmet). Dessa B-celler visade sig ha genuttrycksmönster som skiljer sig från de hos cirkulerande B-celler isolerade från det perifera blodet. Analys av naiva hjärtan från B-cellsbristdjur och syngena kontroller visade att djur som saknade B-celler hade mindre hjärtan och högre utkastningsfraktion⁶. Alla dessa bevis tyder på att B-celler kan modulera myokardiell tillväxt och / eller myokardiell funktion, och att inte bara interstitiella utan också intravaskulära B-celler kan vara ansvariga för sådana observationer. B-celler visade sig också modulera fenotypen för myokardiella makrofager⁸.

Flera studier har visat att B-celler spelar en viktig roll i samband med myokardiell anpassning till skada 8,9,10,11,12,13. B-celler ackumuleras övergående i det skadade hjärtat, sannolikt genom en CXCL13-CXCR5-beroende mekanism^11,13. Därifrån främjar B-celler negativ hjärtombyggnad genom flera mekanismer som inkluderar cytokinmedierad monocytrekrytering ^9,12. Dessutom kan B-celler producera antikroppar mot hjärtproteiner som kan främja förlängningen av hjärtskador och negativ hjärtombyggnad genom flera mekanismer 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-celler kan också utöva skyddande effekter på det skadade hjärtat genom utsöndring av IL-10¹⁰.

I takt med att antalet grupper som undersöker B-cellernas roll i det naiva och skadade hjärtat växer blir det allt viktigare att definiera gemensamma protokoll för att korrekt kvantifiera och bedöma myokardiella B-celler och därmed undvika inkonsekvenser som redan har börjat dyka upp i litteraturen. Hittills har B-celler faktiskt både rapporterats vara en av de vanligaste immuncellerna i gnagarhjärtat⁷ och vara närvarande vid en markant lägre prevalens än myeloida celler^26,27, eller vara ganska sällsynta ²⁸. På samma sätt har flera grupper beskrivit att antalet myokardiella B-celler ökar efter akut ischemisk hjärtskada ^7,9,13, men en grupp rapporterade inga förändringar i antalet B-celler i det skadade myokardiet²⁹. Studier på hjärtimmunceller ger sällan detaljer om perfusionsförhållanden och det finns ingen överenskommelse om matsmältningsförhållandena. Eftersom en stor andel av B-cellerna i gnagarhjärtat är intravaskulära och extraktionen av immunceller från hjärtmuskeln är starkt beroende av den matsmältningsmetod som används, kan skillnaderna som rapporteras i litteraturen vara resultatet av skillnader i organperfusion och vävnadssmältning.

Här presenteras en detaljerad metod för flödescytometribaserad kvantifiering av murina myokardiella B-celler som maximerar utbytet av B-cellåtervinning genom att optimera perfusions- och matsmältningsförhållandena och möjliggör diskriminering av intravaskulära kontra extravaskulära myokardiella B-celler⁶. Detta protokoll är en anpassning och optimering av andra liknande protokoll som skiljer mellan intravaskulära och interstitiella immunceller 28,30,31.

I detta protokoll standardiserar vi myokardiell perfusion för att eliminera B-celler som flyter i det intravaskulära utrymmet utan att ta bort biologiskt relevanta B-celler som följs till det mikrovaskulära endotelet. Dessutom, med utgångspunkt i tidigare protokoll som har beskrivit användningen av intravenös injektion av antikroppar för att skilja intravaskulära från interstitiella immunceller³², och dra nytta av det faktum att B-celler uttrycker ytmarkören B220³³, visar vi hur man skiljer intravaskulära kontra extravaskulära myokardiella B-celler genom intravaskulär injektion av en B220-specifik antikropp omedelbart före djuroffret och hjärtperfusionen. Detta protokoll är relevant för forskningen från alla forskare som är intresserade av att inkludera analysen av myokardiella B-celler i det naiva och skadade hjärtat. Den utbredda implementeringen av detta protokoll kommer att minska inkonsekvenser mellan forskargrupper, möjliggöra analys av förändringar i de intravaskulära och extravaskulära myokardiella B-cellpoolerna och därmed stärka utvecklingen av upptäckter inom hjärtimmunologi.

Sammanfattningsvis representerar protokollet ett optimerat arbetsflöde för att kvantifiera och analysera myokardiella B-celler via flödescytometri och samtidigt skilja mellan celler som ligger i det extravaskulära utrymmet och det intravaskulära utrymmet.