Här rapporterar vi ett protokoll för kvantifiering och differentiering av myokardiella B-lymfocyter baserat på deras placering i det intravaskulära eller endoteliala utrymmet med hjälp av flödescytometri.
En växande mängd bevis visar att B-lymfocyter spelar en viktig roll i samband med myokardiell fysiologi och myokardiell anpassning till skada. Litteraturen rapporterar dock kontrasterande data om förekomsten av myokardiella B-celler. B-celler har rapporterats vara både bland de vanligaste immuncellerna i gnagarhjärtat eller vara närvarande, men med en markant lägre prevalens än myeloida celler, eller för att vara ganska sällsynta. På samma sätt har flera grupper beskrivit att antalet myokardiella B-celler ökar efter akut ischemisk hjärtskada, men en grupp rapporterade inga förändringar i antalet B-celler i det skadade myokardiet. Implementering av en delad, reproducerbar metod för att bedöma förekomsten av myokardiella B-celler är avgörande för att harmonisera observationer från olika forskargrupper och därmed främja utvecklingen av studien av B-cells myokardiella interaktioner. Baserat på vår erfarenhet härrör de till synes kontrasterande observationerna som rapporterats i litteraturen sannolikt från det faktum att murina myokardiella B-celler mestadels är intravaskulära och kopplade till det mikrovaskulära endotelet. Därför är antalet B-celler som återvinns från ett murint hjärta utsökt känsligt för de perfusionsförhållanden som används för att rengöra organet och för den metod för matsmältning som används. Här rapporterar vi ett optimerat protokoll som redovisar dessa två kritiska variabler på ett specifikt sätt. Detta protokoll möjliggör reproducerbar, flödescytometribaserad analys av antalet murina myokardiella B-celler och gör det möjligt för forskare att skilja extravaskulära kontra intravaskulära myokardiella B-celler.
B-lymfocyter är högspecialiserade immunceller som spelar en viktig roll i både adaptiva och medfödda immunsvar1. Det finns två huvudpopulationer av B-celler: en mindre population av B1-celler som mestadels produceras under embryonalt liv och en övervägande population av B2-celler som produceras i vuxenlivet i benmärgen1. Efter mognad i benmärgen migrerar B-celler till primära och sekundära lymfoida organ. Därifrån återcirkulerar de kontinuerligt mellan lymfoida organ som färdas genom blodkärl och lymfkärl2. B-celler uttrycker specifika antikroppar på deras yta, som fungerar som receptorer. När B-celler stöter på ett antigen som binder till deras receptor kan en aktiverande signal utlösas. Aktiverade B-celler migrerar antingen till vävnaden där antigenet hittades eller går tillbaka till benmärgen där de kan mogna till antikroppsproducerande plasmaceller 3,4.
Nyligen har det uppskattats att hjärtat har en stor population av B-celler. Studier på gnagare har visat att B-celler koloniserar hjärtat tidigt under embryonal utveckling5, och att myokardassocierade B-celler mestadels är intravaskulära, naiva B2-celler vidhäftade till endotelet6,7, med en liten andel B1-celler 7. Det finns fortfarande många osäkerhetsområden, men tillgängliga data indikerar att B-celler spelar en viktig roll både i det naiva hjärtat och i samband med myokardiell anpassning till skada.
Studier i det naiva murina hjärtat har visat att vid baslinjen är myokardiella B-celler mestadels belägna i det intravaskulära utrymmet, vidhäftade till endotelet (>95% av murina hjärt-B-celler befanns vara belägna i det intravaskulära utrymmet). Dessa B-celler visade sig ha genuttrycksmönster som skiljer sig från de hos cirkulerande B-celler isolerade från det perifera blodet. Analys av naiva hjärtan från B-cellsbristdjur och syngena kontroller visade att djur som saknade B-celler hade mindre hjärtan och högre utkastningsfraktion6. Alla dessa bevis tyder på att B-celler kan modulera myokardiell tillväxt och / eller myokardiell funktion, och att inte bara interstitiella utan också intravaskulära B-celler kan vara ansvariga för sådana observationer. B-celler visade sig också modulera fenotypen för myokardiella makrofager8.
Flera studier har visat att B-celler spelar en viktig roll i samband med myokardiell anpassning till skada 8,9,10,11,12,13. B-celler ackumuleras övergående i det skadade hjärtat, sannolikt genom en CXCL13-CXCR5-beroende mekanism11,13. Därifrån främjar B-celler negativ hjärtombyggnad genom flera mekanismer som inkluderar cytokinmedierad monocytrekrytering 9,12. Dessutom kan B-celler producera antikroppar mot hjärtproteiner som kan främja förlängningen av hjärtskador och negativ hjärtombyggnad genom flera mekanismer 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-celler kan också utöva skyddande effekter på det skadade hjärtat genom utsöndring av IL-1010.
I takt med att antalet grupper som undersöker B-cellernas roll i det naiva och skadade hjärtat växer blir det allt viktigare att definiera gemensamma protokoll för att korrekt kvantifiera och bedöma myokardiella B-celler och därmed undvika inkonsekvenser som redan har börjat dyka upp i litteraturen. Hittills har B-celler faktiskt både rapporterats vara en av de vanligaste immuncellerna i gnagarhjärtat7 och vara närvarande vid en markant lägre prevalens än myeloida celler26,27, eller vara ganska sällsynta 28. På samma sätt har flera grupper beskrivit att antalet myokardiella B-celler ökar efter akut ischemisk hjärtskada 7,9,13, men en grupp rapporterade inga förändringar i antalet B-celler i det skadade myokardiet29. Studier på hjärtimmunceller ger sällan detaljer om perfusionsförhållanden och det finns ingen överenskommelse om matsmältningsförhållandena. Eftersom en stor andel av B-cellerna i gnagarhjärtat är intravaskulära och extraktionen av immunceller från hjärtmuskeln är starkt beroende av den matsmältningsmetod som används, kan skillnaderna som rapporteras i litteraturen vara resultatet av skillnader i organperfusion och vävnadssmältning.
Här presenteras en detaljerad metod för flödescytometribaserad kvantifiering av murina myokardiella B-celler som maximerar utbytet av B-cellåtervinning genom att optimera perfusions- och matsmältningsförhållandena och möjliggör diskriminering av intravaskulära kontra extravaskulära myokardiella B-celler6. Detta protokoll är en anpassning och optimering av andra liknande protokoll som skiljer mellan intravaskulära och interstitiella immunceller 28,30,31.
I detta protokoll standardiserar vi myokardiell perfusion för att eliminera B-celler som flyter i det intravaskulära utrymmet utan att ta bort biologiskt relevanta B-celler som följs till det mikrovaskulära endotelet. Dessutom, med utgångspunkt i tidigare protokoll som har beskrivit användningen av intravenös injektion av antikroppar för att skilja intravaskulära från interstitiella immunceller32, och dra nytta av det faktum att B-celler uttrycker ytmarkören B22033, visar vi hur man skiljer intravaskulära kontra extravaskulära myokardiella B-celler genom intravaskulär injektion av en B220-specifik antikropp omedelbart före djuroffret och hjärtperfusionen. Detta protokoll är relevant för forskningen från alla forskare som är intresserade av att inkludera analysen av myokardiella B-celler i det naiva och skadade hjärtat. Den utbredda implementeringen av detta protokoll kommer att minska inkonsekvenser mellan forskargrupper, möjliggöra analys av förändringar i de intravaskulära och extravaskulära myokardiella B-cellpoolerna och därmed stärka utvecklingen av upptäckter inom hjärtimmunologi.
Sammanfattningsvis representerar protokollet ett optimerat arbetsflöde för att kvantifiera och analysera myokardiella B-celler via flödescytometri och samtidigt skilja mellan celler som ligger i det extravaskulära utrymmet och det intravaskulära utrymmet.
En växande mängd bevis tyder på att B-celler spelar en viktig roll i samband med myokardiell fysiologi och myokardiell ombyggnad / anpassning till skada 7,8,9,10,11,12,13,36. Flödescytometri är ett utmärkt verktyg för att studera immuncellpopulatione…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie finansierades av NHLBI-bidragen 5K08HLO145108-03 och 1R01HL160716-01 som tilldelades Luigi Adamo.
Aurora Flow Cytometer som användes för att utveckla denna studie finansierades av NIH Grant S10OD026859. Vi erkänner stödet från JHU Ross Flow Cytometry Core.
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
Anesthesia Induction Chamber – Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
DNase I – 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
Easypet 3 – Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
HBSS (1x) – Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
R 4.1.1 | The R Foundation | ||
Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |