基于流式细胞术的心肌B细胞定量和分析

B淋巴细胞是高度特化的免疫细胞，在适应性和先天免疫反应中都起着重要作用¹。B细胞有两个主要群体：较小的B1细胞群，主要在胚胎生命期间产生，以及成年后在骨髓中产生的B2细胞群占^{主导地位1。}在骨髓中成熟后，B细胞迁移到原代和次级淋巴器官。从那里，它们在通过血管和淋巴管的淋巴器官之间不断循环²。B细胞在其表面表达特异性抗体，其作为受体发挥作用。当B细胞遇到与其受体结合的抗原时，可以触发激活信号。活化的B细胞要么迁移到发现抗原的组织，要么回到骨髓，在那里它们可以成熟为产生抗体的浆细胞^3，4。

最近，人们认识到心脏含有大量的B细胞。对啮齿动物的研究表明，B细胞在^{胚胎发育早期}定植在心脏5，并且心肌相关B细胞大多是血管内幼稚的B2细胞粘附在内皮6，7上^，其中B1^{细胞的比例}很小⁷。仍有许多不确定的领域，但现有数据表明，B细胞在幼稚的心脏和心肌适应损伤的背景下都起着重要作用。

对幼稚鼠心脏的研究表明，在基线时心肌B细胞大多位于血管内间隙，粘附在内皮上（发现>95%的小鼠心脏B细胞位于血管内间隙）。发现这些B细胞的基因表达模式与从外周血分离的循环B细胞的基因表达模式不同。对B细胞缺陷动物的幼稚心脏和同系对照的分析发现，缺乏B细胞的动物心脏较小，射血分数^较高6。所有这些证据表明，B细胞可能调节心肌生长和/或心肌功能，不仅间质，而且血管内B细胞都可能负责这种观察。还发现B细胞调节心肌常驻巨噬细胞的表型⁸。

一些研究表明，B细胞在心肌适应损伤的背景下起着重要作用⁸，^9，10，¹¹，^12，13。B细胞在受伤的心脏中短暂积累，可能是通过CXCL13-CXCR5依赖机制^11，13。从那里，B细胞通过几种机制促进不良心脏重塑，包括细胞因子介导的单核细胞募集^9，12。此外，B细胞可以产生针对心脏蛋白的抗体，这些抗体可以通过几种机制促进心脏损伤的扩展和不良心脏重塑¹⁴，15，¹⁶，^17，18，¹⁹，20，21，^22，23，^24，25.B细胞还可以通过分泌IL-10对受伤的心脏发挥保护作用¹⁰。

随着研究B细胞在幼稚和受伤心脏中的作用的小组数量的增加，定义共享协议以正确量化和评估心肌B细胞变得越来越重要，从而避免已经开始出现在文献中的不一致。事实上，据报道，B细胞都是啮齿^{动物心脏中}最常见的免疫细胞之一7，并且其患病率明显低于骨髓细胞26，^27，或者相当罕见²⁸。同样，有几组人描述急性缺血性心^肌损伤后心肌B细胞数量增加7、^9、13，但有一组报告受损心肌B细胞数量没有变化²⁹。对心脏免疫细胞的研究很少给出灌注条件的细节，对消化条件也没有达成共识。由于在啮齿动物心脏中，很大一部分B细胞在血管内，并且从心肌中提取免疫细胞高度依赖于所使用的消化方法，因此文献中报道的差异可能是器官灌注和组织消化差异的结果。

这里介绍的是一种基于流式细胞术的鼠心肌B细胞定量的详细方法，该方法通过优化灌注和消化条件来最大限度地提高B细胞回收率，并允许区分血管内与血管外心肌^B细胞6。该协议是对区分血管内和间质免疫细胞的其他类似方案的改编和优化²⁸，^30，31。

在该协议中，我们将心肌灌注标准化，以消除漂浮在血管内空间中的B细胞，而无需去除粘附在微血管内皮上的生物学相关B细胞。此外，基于先前描述使用静脉注射抗体来区分血管内和间质免疫细胞^的方案32，并利用B细胞表达表面标志物B220³³的事实，我们演示了如何通过在动物处死和心脏灌注前立即血管内注射B220特异性抗体来区分血管内和血管外心肌B细胞。该协议与任何有兴趣包括幼稚和受伤心脏中心肌B细胞分析的科学家的研究相关。该协议的广泛实施将减少研究小组之间的不一致，将允许分析血管内和血管外心肌B细胞库的变化，从而促进心脏免疫学领域发现的进步。

总之，该协议代表了一种优化的工作流程，可通过流式细胞术量化和分析心肌B细胞，同时区分位于血管外空间和血管内间隙的细胞。