유세포분석 기반 심근 B 세포의 정량화 및 분석

B-림프구는 적응^{면역 반응과} 선천성 면역 반응 모두에서 중요한 역할을 하는 고도로 전문화된 면역 세포입니다1. B 세포의 두 가지 주요 집단이 있습니다 : 배아 생활 동안 주로 생성되는 B1 세포의 작은 집단과 골수¹에서 성인 생활에서 생성되는 B2 세포의 우세한 집단. 골수에서 성숙 한 후 B 세포는 1 차 및 2 차 림프 기관으로 이동합니다. 거기에서 그들은 혈관과 림프관을 통해 이동하는 림프 기관 사이에서 지속적으로 재순환합니다². B 세포는 수용체로 기능하는 표면에 특정 항체를 발현합니다. B 세포가 수용체에 결합하는 항원을 만나면 활성화 신호가 트리거 될 수 있습니다. 활성화된 B 세포는 항원이 발견된 조직으로 이동하거나 골수로 돌아가 항체 생성 형질 세포로 성숙할 수 있습니다 ^3,4.

최근에, 심장에는 상당한 수의 B 세포 집단이 있다는 것이 인식되고 있다. 설치류를 대상으로 한 연구에 따르면 B 세포는 배아 발달 초기에 심장에 식민지화되며⁵, 심근 관련 B 세포는 대부분 혈관 내 순진한 B2 세포이며 내피 ^6,7에 부착되어 있으며 B1^세포는 적은 비율입니다⁷. 여전히 많은 불확실성이 있지만 사용 가능한 데이터는 B 세포가 순진한 심장과 부상에 대한 심근 적응의 맥락에서 중요한 역할을한다는 것을 나타냅니다.

순진한 쥐 심장에 대한 연구에 따르면 기준선에서 심근 B 세포는 대부분 혈관 내 공간에 위치하며 내피에 부착되어 있습니다 (> 쥐 심장 B 세포의 95 %가 혈관 내 공간에 위치하는 것으로 밝혀졌습니다). 이들 B 세포는 말초 혈액으로부터 분리된 순환 B 세포와 상이한 유전자 발현 패턴을 갖는 것으로 밝혀졌다. B 세포가 결핍 된 동물과 동종 대조군의 순진한 심장을 분석 한 결과, B 세포가없는 동물은 심장이 더 작고 분출률이 더 높은 것으로 나타났습니다⁶. 이 모든 증거는 B 세포가 심근 성장 및 / 또는 심근 기능을 조절할 수 있으며 간질뿐만 아니라 혈관 내 B 세포도 그러한 관찰을 담당 할 수 있음을 시사합니다. B 세포는 또한 심근 상주 대식세포의 표현형을 조절하는 것으로 밝혀졌습니다⁸.

여러 연구에 따르면 B 세포는 손상에 대한 심근 적응의 맥락에서 중요한 역할을합니다 8,9,10,11,12,13. B 세포는 CXCL13-CXCR5 의존성 메커니즘^11,13을 통해 손상된 심장에 일시적으로 축적됩니다. 거기에서 B 세포는 사이토 카인 매개 단핵구 모집 ^9,12를 포함하는 여러 메커니즘을 통해 불리한 심장 리모델링을 촉진합니다. 또한, B- 세포는 여러 메커니즘을 통해 심장 손상 및 불리한 심장 리모델링의 확장을 촉진 할 수있는 심장 단백질에 대한 항체를 생산할 수 있습니다 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B 세포는 또한 IL-10¹⁰의 분비를 통해 손상된 심장에 보호 효과를 발휘할 수 있습니다.

순진하고 손상된 심장에서 B 세포의 역할을 조사하는 그룹의 수가 증가함에 따라 심근 B 세포를 적절하게 정량화하고 평가하여 이미 문헌에 나타나기 시작한 불일치를 피하기 위해 공유 프로토콜을 정의하는 것이 점점 더 중요 해지고 있습니다. 지금까지 B 세포는 실제로 설치류 심장에서 가장 널리 퍼진 면역 세포^중 하나이며7 골수 세포^26,27보다 현저히 낮은 유병률로 존재하거나 매우 드문 것으로 보고되었습니다²⁸. 유사하게, 몇몇 그룹은 급성 허혈성 심근 손상^후에 심근 B 세포의 수가 증가한다고 설명^{했지만, 한} 그룹은 손상된 심근²⁹의 B 세포 수에 변화가 없다고보고했다. 심장 면역 세포에 대한 연구는 관류 상태에 대한 세부 정보를 거의 제공하지 않으며 소화 조건에 대한 합의가 없습니다. 설치류 심장에서 B 세포의 상당 부분이 혈관 내이고 심근에서 면역 세포를 추출하는 것은 사용 된 소화 방법에 크게 의존하기 때문에 문헌에보고 된 차이는 장기 관류 및 조직 소화의 차이의 결과 일 수 있습니다.

여기에 제시된 것은 관류 및 소화 조건을 최적화하여 B 세포 회수의 수율을 최대화하고 혈관 내 대 혈관 외 심근 B 세포의 구별을 허용하는 쥐 심근 B 세포의 유세포 분석 기반 정량화에 대한 자세한 방법입니다⁶. 이 프로토콜은 혈관내 및 간질 면역 세포 28,30,31을 구별하는 다른 유사한 프로토콜의 적응 및 최적화이다.

이 프로토콜에서 우리는 심근 관류를 표준화하여 미세 혈관 내피에 부착 된 생물학적으로 관련된 B 세포를 제거하지 않고 혈관 내 공간에 떠 다니는 B 세포를 제거합니다. 더욱이, 혈관내 면역 세포(32)와 간질 면역 세포(³²)를 구별하기 위해 항체의 정맥내 주사의 사용을 기술한 이전 프로토콜을 구축하고, B-세포가 표면 마커 B220(³³)을 발현한다는 사실을 이용하여, 동물 희생 및 심장 관류 직전에 B220-특이적 항체의 혈관내 주사를 통해 혈관내 대 혈관외 심근 B 세포를 구별하는 방법을 입증한다. 이 프로토콜은 순진하고 손상된 심장의 심근 B 세포 분석을 포함하는 데 관심이있는 모든 과학자의 연구와 관련이 있습니다. 이 프로토콜의 광범위한 구현은 연구 그룹 간의 불일치를 줄이고 혈관 내 및 혈관 외 심근 B 세포 풀의 변화를 분석 할 수있게하여 심장 면역학 분야의 발견을 강화할 것입니다.

요약하면, 이 프로토콜은 유세포분석을 통해 심근 B 세포를 정량화 및 분석하는 동시에 혈관외 공간과 혈관내 공간에 위치한 세포를 구별하는 최적화된 워크플로우를 나타냅니다.