यहां हम फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके इंट्रावास्कुलर या एंडोथेलियल स्पेस में उनके स्थान के आधार पर मायोकार्डियल बी-लिम्फोसाइटों के परिमाणीकरण और भेदभाव के लिए एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं।
साक्ष्य के बढ़ते शरीर से पता चलता है कि बी-लिम्फोसाइट्स मायोकार्डियल फिजियोलॉजी और चोट के मायोकार्डियल अनुकूलन के संदर्भ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, साहित्य मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं के प्रसार पर विपरीत डेटा की रिपोर्ट करता है। बी-कोशिकाओं को कृंतक हृदय में सबसे प्रचलित प्रतिरक्षा कोशिकाओं में से एक या मौजूद होने की सूचना दी गई है, लेकिन माइलॉयड कोशिकाओं की तुलना में स्पष्ट रूप से कम प्रसार पर, या काफी दुर्लभ है। इसी तरह, कई समूहों ने वर्णन किया है कि तीव्र इस्केमिक मायोकार्डियल चोट के बाद मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है, लेकिन एक समूह ने घायल मायोकार्डियम के बी-कोशिकाओं की संख्या में कोई बदलाव नहीं होने की सूचना दी। मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं की व्यापकता का आकलन करने के लिए एक साझा, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का कार्यान्वयन विभिन्न शोध समूहों से टिप्पणियों को सुसंगत करने के लिए महत्वपूर्ण है और इस प्रकार बी-सेल मायोकार्डियल इंटरैक्शन के अध्ययन की प्रगति को बढ़ावा देता है। हमारे अनुभव के आधार पर, साहित्य में रिपोर्ट किए गए प्रतीत होने वाले विपरीत अवलोकन संभवतः इस तथ्य से उपजा है कि मुराइन मायोकार्डियल बी-कोशिकाएं ज्यादातर इंट्रावास्कुलर हैं और माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियम से जुड़ी हैं। इसलिए, मुराइन हृदय से बरामद बी-कोशिकाओं की संख्या अंग को साफ करने और उपयोग की जाने वाली पाचन की विधि के लिए उपयोग की जाने वाली छिड़काव स्थितियों के प्रति अति संवेदनशील है। यहां हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं जो एक विशिष्ट तरीके से इन दो महत्वपूर्ण चर के लिए जिम्मेदार है। यह प्रोटोकॉल मुराइन मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं की संख्या के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विश्लेषण को सशक्त बनाता है और शोधकर्ताओं को एक्स्ट्रावस्कुलर बनाम इंट्रावास्कुलर मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति देता है।
बी-लिम्फोसाइट्स अत्यधिक विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाएं हैं जो अनुकूली और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं दोनों में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाती हैं। बी-कोशिकाओं की दो मुख्य आबादी हैं: बी 1 कोशिकाओं की एक छोटी आबादी जो ज्यादातर भ्रूण के जीवन के दौरान उत्पन्न होती है, और बी 2 कोशिकाओं की एक प्रधान आबादी जो अस्थि मज्जा1 में वयस्क जीवन में उत्पन्न होती है। अस्थि मज्जा में परिपक्व होने के बाद, बी-कोशिकाएं प्राथमिक और द्वितीयक लिम्फोइड अंगों में स्थानांतरित हो जाती हैं। वहां से वे रक्त वाहिकाओं और लसीका वाहिकाओं के माध्यम से यात्रा करने वाले लिम्फोइड अंगोंके बीच लगातार पुन: परिचालित होते हैं। बी-कोशिकाएं अपनी सतह पर विशिष्ट एंटीबॉडी व्यक्त करती हैं, जो रिसेप्टर्स के रूप में कार्य करती हैं। जब बी-कोशिकाएं एक एंटीजन का सामना करती हैं जो उनके रिसेप्टर को बांधती है, तो एक सक्रिय संकेत ट्रिगर किया जा सकता है। सक्रिय बी-कोशिकाएं या तो ऊतक में स्थानांतरित हो जाती हैं जहां एंटीजन पाया गया था या अस्थि मज्जा में वापस जाते हैं जहां वे एंटीबॉडी-उत्पादक प्लाज्मा कोशिकाओं 3,4 में परिपक्व हो सकते हैं।
हाल ही में, यह सराहना की गई है कि दिल बी-कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी को आश्रय देता है। कृन्तकों में अध्ययन से पता चला है कि बी-कोशिकाएं भ्रूण के विकासके दौरान दिल को जल्दी उपनिवेशित करती हैं, और यह कि मायोकार्डियल-संबद्ध बी-कोशिकाएं ज्यादातर इंट्रावास्कुलर, भोले बी 2 कोशिकाएं एंडोथेलियम 6,7 का पालन करती हैं, जिसमें बी 1 कोशिकाओं का एक छोटा प्रतिशतहोता है। अभी भी अनिश्चितता के कई क्षेत्र हैं, लेकिन उपलब्ध डेटा इंगित करता है कि बी-कोशिकाएं भोले दिल में और चोट के मायोकार्डियल अनुकूलन के संदर्भ में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं।
भोले मुराइन दिल में अध्ययन से पता चला है कि बेसलाइन मायोकार्डियल बी-कोशिकाएं ज्यादातर इंट्रावास्कुलर स्पेस में स्थित होती हैं, एंडोथेलियम का पालन करती हैं (>95% म्यूरिन कार्डियक बी-कोशिकाएं इंट्रावास्कुलर स्पेस में स्थित पाई गईं)। इन बी कोशिकाओं में परिधीय रक्त से पृथक परिसंचारी बी कोशिकाओं से अलग जीन अभिव्यक्ति पैटर्न पाए गए। बी-सेल की कमी वाले जानवरों और सिंजेनिक नियंत्रणों से भोले दिलों के विश्लेषण में पाया गया कि बी-कोशिकाओं की कमी वाले जानवरों में छोटे दिल और उच्च इजेक्शन अंश6 थे। इन सभी सबूतों से पता चलता है कि बी-कोशिकाएं मायोकार्डियल विकास और / या मायोकार्डियल फ़ंक्शन को संशोधित कर सकती हैं, और यह कि न केवल अंतरालीय बल्कि इंट्रावास्कुलर बी-कोशिकाएं भी ऐसी टिप्पणियों के लिए जिम्मेदार हो सकती हैं। बी-कोशिकाओं को मायोकार्डियल निवासी मैक्रोफेज 8 के फेनोटाइप कोसंशोधित करने के लिए भी पाया गया था।
कई अध्ययनों से पता चला है कि बी-कोशिकाएं चोट 8,9,10,11,12,13 के मायोकार्डियल अनुकूलन के संदर्भ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। बी-कोशिकाएं घायल दिल में क्षणिक रूप से जमा होती हैं, संभवतः एक 11,13 के माध्यम से एक सीएक्स13-सीएक्ससीआर 5निर्भर तंत्र के माध्यम से। वहां से, बी-कोशिकाएं कई तंत्रों के माध्यम से प्रतिकूल कार्डियक रीमॉडेलिंग को बढ़ावा देती हैं जिसमें साइटोकिन-मध्यस्थता मोनोसाइट भर्ती 9,12 शामिल हैं। इसके अलावा, बी-कोशिकाएं कार्डियक प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उत्पादन कर सकती हैं जो कईतंत्रों के माध्यम से कार्डियक क्षति और प्रतिकूल कार्डियक रीमॉडेलिंग के विस्तार को बढ़ावा दे सकती हैं 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . बी-कोशिकाएं आईएल -10 10 के स्राव के माध्यम से घायल दिल पर सुरक्षात्मक प्रभाव भी डाल सकतीहैं।
जैसे-जैसे भोले और घायल दिल में बी-कोशिकाओं की भूमिका की जांच करने वाले समूहों की संख्या बढ़ती है, मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं को ठीक से मापने और उनका आकलन करने के लिए साझा प्रोटोकॉल को परिभाषित करना अधिक से अधिक महत्वपूर्ण होता जा रहा है और इस प्रकार विसंगतियों से बचा जा सकता है जो पहले से ही साहित्य में दिखाई देने लगे हैं। अब तक बी-कोशिकाओं को वास्तव में कृंतक हृदय7 में सबसे प्रचलित प्रतिरक्षा कोशिकाओं में से एक बताया गया है और माइलॉयड कोशिकाओं26,27 की तुलना में स्पष्ट रूप से कम प्रसार पर मौजूद है, या काफी दुर्लभ28 है। इसी तरह, कई समूहों ने वर्णन किया है कि तीव्र इस्केमिक मायोकार्डियल चोट 7,9,13 के बाद मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है, लेकिन एक समूह ने घायल मायोकार्डियम29 की बी-कोशिकाओं की संख्या में कोई बदलाव नहीं होने की सूचना दी। कार्डियक प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर अध्ययन शायद ही कभी छिड़काव स्थितियों पर विवरण देते हैं और पाचन स्थितियों पर कोई सहमति नहीं है। चूंकि कृंतक हृदय में बी-कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा इंट्रावास्कुलर होता है और मायोकार्डियम से प्रतिरक्षा कोशिकाओं का निष्कर्षण उपयोग की जाने वाली पाचन विधि पर अत्यधिक निर्भर होता है, साहित्य में रिपोर्ट किए गए अंतर अंग छिड़काव और ऊतक पाचन में अंतर का परिणाम हो सकते हैं।
यहां प्रस्तुत म्यूरिन मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित परिमाणीकरण के लिए एक विस्तृत विधि है जो छिड़काव और पाचन स्थितियों को अनुकूलित करके बी-सेल रिकवरी की उपज को अधिकतम करती है और इंट्रावास्कुलर बनाम एक्स्ट्रावास्कुलर मायोकार्डियल बी-कोशिकाओंके भेदभाव की अनुमति देती है। यह प्रोटोकॉल अन्य समान प्रोटोकॉल का अनुकूलन और अनुकूलन है जो इंट्रावास्कुलर और अंतरालीय प्रतिरक्षा कोशिकाओं 28,30,31 के बीच अंतर करता है।
इस प्रोटोकॉल में, हम माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियम का पालन करने वाली जैविक रूप से प्रासंगिक बी-कोशिकाओं को हटाए बिना इंट्रावास्कुलर स्पेस में तैरने वाली बी-कोशिकाओं को खत्म करने के लिए मायोकार्डियल छिड़काव को मानकीकृत करते हैं। इसके अलावा, पूर्व प्रोटोकॉल के आधार पर, जिन्होंने अंतरालीय प्रतिरक्षा कोशिकाओं32 से इंट्रावास्कुलर को अलग करने के लिए एंटीबॉडी के अंतःशिरा इंजेक्शन के उपयोग का वर्णन किया है, और इस तथ्य का लाभ उठाते हुए कि बी-कोशिकाएं सतह मार्कर बी 22033 को व्यक्त करती हैं, हम प्रदर्शित करते हैं कि पशु बलिदान और कार्डियक छिड़काव से तुरंत पहले बी 220-विशिष्ट एंटीबॉडी के इंट्रावास्कुलर इंजेक्शन के माध्यम से इंट्रावास्कुलर बनाम एक्स्ट्रावास्कुलर मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं को कैसे अलग किया जाए। यह प्रोटोकॉल भोले और घायल दिल में मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं के विश्लेषण को शामिल करने में रुचि रखने वाले किसी भी वैज्ञानिक के शोध के लिए प्रासंगिक है। इस प्रोटोकॉल का व्यापक कार्यान्वयन अनुसंधान समूहों के बीच विसंगतियों को कम करेगा, इंट्रावास्कुलर और एक्स्ट्रावस्कुलर मायोकार्डियल बी-सेल पूल में परिवर्तन के विश्लेषण की अनुमति देगा, और इस प्रकार कार्डियक इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में खोजों की प्रगति को बढ़ावा देगा।
सारांश में, प्रोटोकॉल फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से मायोकार्डियल बी-कोशिकाओं को मापने और विश्लेषण करने के लिए एक अनुकूलित वर्कफ़्लो का प्रतिनिधित्व करता है, और एक ही समय में एक्स्ट्रावस्कुलर स्पेस और इंट्रावास्कुलर स्पेस में स्थित कोशिकाओं के बीच अंतर करता है।
साक्ष्य का एक बढ़ता शरीर इंगित करता है कि बी-कोशिकाएं मायोकार्डियल फिजियोलॉजी और मायोकार्डियल रीमॉडेलिंग / चोट 7,8,9,10,11,12,13,36 के संदर्भ में एक महत्व…
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को एनएचएलबीआई अनुदान 5K08HLO145108-03 और 1R01HL160716-01 द्वारा लुइगी अदामो को प्रदान किया गया था।
इस अध्ययन को विकसित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले ऑरोरा फ्लो साइटोमीटर को एनआईएच ग्रांट एस 10ओडी026859 द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम जेएचयू रॉस फ्लो साइटोमेट्री कोर के समर्थन को स्वीकार करते हैं।
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody | 101222 | BioLegend | 100 µg 200 µL |
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue | QBIAP303 | Southern Labware | |
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1605-0000 | SealRite, USA Scientific | |
0.9% Sodium Chloride Injection, USP | 114-055-101 | Quality Biological | 0.90% |
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube | 1615-5500 | SealRite, USA Scientific | |
10 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11213810 | USA Scientific | |
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11267810 | USA Scientific | |
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430052 | Corning | |
1-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT951 | ECT Manufacturing | |
2,2,2-Tribromoethanol | T48402 | Sigma-Aldrich | |
200 µL Graduated TipOne Filter Tips | 11208810 | USA Scientific | |
3-Way Stop Valve, Polycarbonate | SVPT953 | ECT Manufacturing | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style | 352054 | Falcon, a Corning Brand | |
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free | 430290 | Corning | |
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer | 118-156-101 | Quality Biological | Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20 |
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63 | 5810759005 | Eppendorf | |
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62 | 22638289 | Eppendorf | |
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62 | 22638246 | Eppendorf | |
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007 | UPC 109153 | Reynolds Wrap | |
Anesthesia Induction Chamber – Mouse | RWD-AICMV-100 | Conduct Science | |
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL | 309626 | BD Becton, Dickinson and Company | |
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack | CMD 2613 | Brandzig | |
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody | 115537 | BioLegend | 50 µg/mL |
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile | T9009 | Southern Labware | |
Carbon Dioxide USP E CGA 940 | CD USPE | AirGas USA | |
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL | UX-34502-46 | Cole-Parmer | |
Collagenase 2 | LS004176 | Sigma-Aldrich | |
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb | Y992611-AG | AirGas USA | |
Cytek Aurora Flow Cytometer | Cytek Biosciences | ||
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP | M-08-12 | AirGas USA | |
DNase I – 40,000 U | D4527 | Sigma-Aldrich | |
Easypet 3 – Electronic Pipette Controller | 4430000018 | Eppendorf | |
Electronic Balance, AX223/E | 30100606 | Ohaus Corp. | |
Eppendorf 5810R centrifuge | 5810R | Eppendorf | |
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes | Eppendorf | ||
FlowJo 10.8.1 | BD Becton, Dickinson and Company | ||
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100) | Z740287 | Heathrow Scientific | |
HBSS (1x) – Ca2+ [+] Mg2+ [+] | 14025076 | gibco | 1x |
Hyaluronidase | H3506 | Sigma-Aldrich | |
Kelly Hemostats, Straight | 13018-14 | Fine Science Tools | |
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL | 302831 | BD Becton, Dickinson and Company | |
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940 | M1-940-PG | AirGas USA | |
McKesson Underpads, Moderate | 4033-CS150 | McKesson | |
Navigator Multi-Purpose Portable Balance | NV2201 | Ohaus Corp. | |
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-] | 10010023 | gibco | 1x |
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody | 103208 | BioLegend | 200 µg/mL |
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody | 103132 | BioLegend | 100 µg 500 uL |
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene | FB0875711YZ | Fisher Scientific | |
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02 | M08-1 | AirGas USA | |
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator | LED-6W | AmScope | |
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm) | 305122 | BD Becton, Dickinson and Company | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO) | 553141 | BD Becton, Dickinson and Company Biosciences | 0.5 mg/mL |
R 4.1.1 | The R Foundation | ||
Razor Blades | 9501250000 | Accutec Blades Inc | |
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet | Y12244A320-AG | AirGas USA | |
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets | Rotor A-4-62 | Eppendorf | |
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister | 86.1254.001 | Sarstedt AG & Co KG | |
Sigma label tape | L8394 | Sigma-Aldrich | |
SpectroFlo 3.0.0 | Cytek Biosciences | ||
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA | MTLL230-6005 | Spex | |
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long | CG-730-003 | Excelon Laboratory | |
Syringe PP/PE without needle, 3 mL | Z683566 | Millipore Sigma | |
Syringe pump | 55-1199 (95-240) | Harvard Apparatus | |
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500 | 9371W13 | Thomas Scientific | |
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119835 | Eppendorf | |
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable | 30119827 | Eppendorf | |
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in. | T8913 (Millipore Sigma) | Tygon, Saint-Gobain | |
Vortex-Genie 2 | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. | |
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips | 89259-946 | Avantor, by VWR | |
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½" | 82027-578 | Avantor, by VWR | |
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I | 12620-946 | Avantor, by VWR | |
Zombie Aqua Fixable Viability Kit | 423102 | BioLegend |