Summary

Humane Mikroglia-ähnliche Zellen: Differenzierung aus induzierten pluripotenten Stammzellen und In-vitro-Lebendzell-Phagozytose-Assay mit humanen Synaptosomen

Published: August 18, 2022
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt den Differenzierungsprozess von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) in Mikroglia-ähnliche Zellen für In-vitro-Experimente. Wir enthalten auch ein detailliertes Verfahren zur Erzeugung menschlicher Synaptosomen aus iPSC-abgeleiteten unteren Motoneuronen, die als Substrat für In-vitro-Phagozytose-Assays mit Lebendzellbildgebungssystemen verwendet werden können.

Abstract

Mikroglia sind die ansässigen Immunzellen myeloischen Ursprungs, die die Homöostase in der Mikroumgebung des Gehirns aufrechterhalten und zu einem Schlüsselakteur bei mehreren neurologischen Erkrankungen geworden sind. Die Untersuchung menschlicher Mikroglia in Gesundheit und Krankheit stellt aufgrund der extrem begrenzten Versorgung mit menschlichen Zellen eine Herausforderung dar. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen), die von menschlichen Individuen stammen, können verwendet werden, um diese Barriere zu umgehen. Hier wird gezeigt, wie menschliche iPS-Zellen in Mikroglia-ähnliche Zellen (iMGs) für In-vitro-Experimente differenziert werden können. Diese iMGs zeigen die erwarteten und physiologischen Eigenschaften von Mikroglia, einschließlich Mikroglia-ähnlicher Morphologie, Expression geeigneter Marker und aktiver Phagozytose. Zusätzlich wird eine Dokumentation zur Isolierung und Markierung von Synaptosomensubstraten bereitgestellt, die von humanen iPSC-abgeleiteten unteren Motoneuronen (i3LMNs) stammen. Ein Lebendzell-Longitudinal-Imaging-Assay wird verwendet, um das Verschlingen menschlicher Synaptosomen zu überwachen, die mit einem pH-empfindlichen Farbstoff markiert sind, was Untersuchungen der phagozytischen Kapazität von iMG ermöglicht. Die hierin beschriebenen Protokolle sind allgemein auf verschiedene Bereiche anwendbar, die die Biologie der menschlichen Mikroglia und den Beitrag von Mikroglia zur Krankheit untersuchen.

Introduction

Mikroglia sind die residenten Immunzellen im zentralen Nervensystem (ZNS) und spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung des ZNS. Mikroglia sind auch im erwachsenen Gehirn wichtig, um die Homöostase aufrechtzuerhalten und aktiv auf Traumata und Krankheitsprozesse zu reagieren. Kumulative Evidenz zeigt, dass Mikroglia einen Schlüsselbeitrag zur Pathogenese multipler neuroentwicklungsbedingter und neurodegenerativer Erkrankungen leisten 1,2. Obwohl das aktuelle Wissen über die Mikrogliabiologie überwiegend aus Mausmodellen abgeleitet wurde, haben neuere Studien wichtige Unterschiede zwischen murinen und menschlichen Mikroglia aufgeklärt, was die Notwendigkeit der Entwicklung von Technologien zur Untersuchung der Genetik und der biologischen Funktionen menschlicher Mikroglia unterstreicht 3,4. Die Isolierung von Mikroglia aus seziertem Primärgewebe kann die Eigenschaften der Mikroglia stark verändern5, was möglicherweise die mit solchen Zellen erzielten Ergebnisse verwirrt. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, humane iPS-Zellen in iMGs zu differenzieren und dadurch ein Zellkultursystem zur Untersuchung menschlicher Mikroglia unter basalen Bedingungen bereitzustellen. Darüber hinaus ist hierin ein Phagozytose-Assay unter Verwendung eines vollständig menschlichen Modellsystems enthalten, um die Funktionalität von iMGs sowohl als Qualitätskontrollmaßnahme als auch zur Beurteilung der iMG-Dysfunktion im Kontext der Krankheit zu untersuchen.

Mehrere Protokolle zur Mikroglia-Differenzierung von iPS-Zellen sind kürzlich in der Literatur 6,7,8,9,10 aufgetaucht. Mögliche Nachteile einiger Protokolle sind verlängerte oder lange Differenzierungsperioden, die Zugabe mehrerer Wachstumsfaktoren und/oder komplexe experimentelle Verfahren 6,9,10. Hier wird eine “benutzerfreundliche” Differenzierungsmethode demonstriert, die Aspekte der Mikroglia-Ontogenese durch Differenzierung von iPS-Zellen in Vorläuferzellen, die als primitive Makrophagen-Vorläufer (PMPs) bezeichnet werden, rekapituliert7,11. PMPs werden wie zuvor beschrieben generiert, wobei einige Optimierungen hierin12 vorgestellt werden. Die PMPs ahmen MYB-unabhängige Dottersack-abgeleitete Makrophagen nach, die während der Embryonalentwicklung Mikroglia erzeugen, indem sie vor dem Schließen der Blut-Hirn-Schranke in das Gehirn eindringen13. Um PMPs in iMGs zu differenzieren, verwendeten wir eine schnelle und vereinfachte Monokulturmethode, die auf Protokollen von Haenseler et al. und Brownjohn et al. basiert, mit einigen Modifikationen, um eine effiziente Mikroglia-Differenzierungsmethode zu erzeugen, in der iMGs Mikroglia-angereicherte Marker robust exprimieren 7,8. Diese Differenzierungsmethode kann in Laboratorien mit Expertise in der Kultur von iPSCs und mit Forschungszielen reproduziert werden, die darauf abzielen, die Mikrogliabiologie anhand eines humanen Modellsystems zu untersuchen.

iPSC-abgeleitete Mikroglia stellen eine biologisch relevante Quelle menschlicher Mikroglia für In-vitro-Experimente dar und sind ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung mikroglialer kanonischer Funktionen, einschließlich Phagozytose. Mikroglia sind die professionellen Phagozyten des Gehirns und des ZNS, wo sie Zelltrümmer, aggregierte Proteine und abgebautes Myelin14 entfernen. Mikroglia funktionieren auch beim synaptischen Umbau durch Verschlingen von Synapsen und bei der Abwehr äußerer Infektionen durch Phagozytose von Krankheitserregern15,16. In diesem Protokoll wird die Phagozytose durch iMGs unter Verwendung menschlicher Synaptosomen als Material für das iMG-Engulfment bewertet. Zu diesem Zweck wird eine Beschreibung zur Isolierung von Synaptosomen beschrieben, die von humaneni3LMNs abgeleitet sind. Die i3-LMN-abgeleiteten menschlichen Synaptosomen sind mit einem pH-sensitiven Farbstoff markiert, der die Quantifizierung von Synaptosomen ermöglicht, die während der Phagosomenverarbeitung und des Abbaus in vitro in sauren Kompartimenten lokalisiert sind. Ein Phagozytose-Assay mit Lebendzellmikroskopie wird gezeigt, um den dynamischen Prozess der Mikroglia-Verschlängung in Echtzeit zu überwachen. Dieser funktionelle Assay schafft eine Grundlage, um mögliche Defekte der Mikroglia-Phagozytose in Gesundheit und Krankheit mit einem vollständigen menschlichen System zu untersuchen.

Protocol

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll verwendeten Reagenzien müssen steril sein, und alle Schritte müssen in einer Biosicherheitswerkbank unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Alle iPSC-Linien sowie Wartungs- und Differenzierungsmedien sind im Materialverzeichnis beschrieben. Die unten dargestellte Mikroglia-Differenzierungsmethode basiert auf den zuvor veröffentlichten Protokollen 7,8,12 mit den hieri…

Representative Results

Um iMGs mit diesem Protokoll zu generieren, ist es wichtig, mit undifferenzierten iPSCs zu beginnen, die eine kompakte Koloniemorphologie mit gut definierten Kanten aufweisen (Abbildung 2A). Dissoziierte iPSCs, die wie im Abschnitt EB-Bildung beschrieben beibehalten werden, bilden sphärische Aggregate, die als EBs bezeichnet werden und bis zum Tag 4 der Differenzierung an Größe zunehmen (Abbildung 2B). Sobald die EBs gesammelt und unter den geeigneten Bedingu…

Discussion

Das hier beschriebene Differenzierungsprotokoll bietet eine effiziente Methode, um iPSC-abgeleitete Mikroglia-ähnliche Zellen in ~6-8 Wochen mit hoher Reinheit und in ausreichender Ausbeute zu erhalten, um Immunfluoreszenzexperimente und andere Assays durchzuführen, die eine höhere Anzahl von Zellen erfordern. Dieses Protokoll hat bis zu 1 × 106 iMGs in 1 Woche ergeben, was eine Protein- und RNA-Extraktion und entsprechende Downstream-Analysen (z.B. RNASeq, qRT-PCR, Western Blot, Massenspektrometrie) ermö…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Michael Ward für die Bereitstellung der WTC11 hNIL iPSC-Linie für die Motoneuronendifferenzierung und den Jackson Laboratories für die Lieferung der KOLF2.1J WT-Klon-B03-iPSC-Linie für die Mikroglia-Differenzierung. Wir danken auch Dorothy Schafer für ihre Unterstützung bei der Implementierung der Protokolle, Anthony Giampetruzzi und John Landers für ihre Hilfe beim Lebendzellbildgebungssystem sowie Hayden Gadd für seine technischen Beiträge während der Überarbeitung und Jonathan Jung für seine Mitarbeit an dieser Studie. Diese Arbeit wurde vom Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience der UMASS Chan Medical School und dem Angel Fund, Inc. unterstützt.

Materials

Antibodies for immunofluorescence analysis
anti-IBA1 rabbit antibody Wako Chemical USA NC9288364 1:350 dilution
anti-P2RY12 rabbit antibody Sigma-Aldrich HPA014518 1:50 dilution
anti-TMEM119 rabbit antibody Sigma-Aldrich HPA051870 1:100 dilution
Antibodies for Western blot analysis
anti-β-Tubulin rabbit antibody Abcam ab6046 1:500 dilution
anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody Abclonal A6344 1:1,000 dilution
anti-PSD95 mouse antibody Millipore MAB1596 1:500 dilution
Borate buffer components
Boric acid (100 mM) Sigma B6768
Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (75 mM) Sigma  S7653
Sodium tetraborate (25 mM) Sigma 221732
Cell culture materials
6-well plates Greiner Bio-One 657160
40 μm Cell Strainers  Falcon 352340
100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated CELLTREAT 229620
Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile CELLTREAT 229305
low adherence round-bottom 96-well plate Corning 7007
Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate Corning 353847,
Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate Corning 353846
Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate Corning 353872
Cell dissociation reagents
Accutase  Corning 25058CI dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation
TrypLE reagent Life Technologies 12-605-010 dissociation reagents used for microglia differentiation
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020
Coating reagents for cell culture
Matrigel GFR Membrane Matrix Corning™ 354230 Referred as to extracellular matrix coating reagent
CellAdhere Laminin-521 STEMCELL Technology 77004 Referred as to laminin 521
Poly-D-Lysine Sigma P7405 Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer
Poly-L-Ornithine Sigma  P3655 Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer
Components of iPSC media
 mTeSR Plus Kit STEMCELL Technology 100-0276 To prepare iPSC media mixed the components to 1x
Components of EB media
BMP-4 Fisher Scientific PHC9534 final concentration 50 ng/mL
iPSC media final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632 Fisher Scientific BD 562822 final concentration 10 µM
SCF PeproTech 300-07 final concentration 20 ng/mL
VEGF PeproTech 100-20A final concentration 50 ng/mL
Components of PMP base media
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122 final concentration 100 U/mL
X-VIVO 15 Lonza 12001-988 final concentration 1x
Components of PMP complete media
55 mM 2-mercaptoethanol Gibco 21985023 final concentration 55 µM
IL-3 PeproTech 200-03 final concentration 25 ng/mL
M-CSF PeproTech 300-25 final concentration 100 ng/mL
PMP base media final concentration 1x
Components of iMG base media
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634010 final concentration 1x
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
N2 supplement, 100x Gibco 17502-048 final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122 final concentration 100 U/mL
Components of iMG complete media
55 mM 2-mercaptoethanol Gibco 21985023 final concentration 55 µM
IL-34 PeproTech or Biologend 200-34 or 577904 final concentration 100 ng/mL
iMG base media final concentration 1x
M-CSF PeproTech 300-25 final concentration 5 ng/mL
TGF-β PeproTech 100-21 final concentration 50 ng/mL
Components of Induction base media
DMEM/F12 with HEPES Gibco 11330032 final concentration 1x
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
N2 supplement, 100x Gibco 17502-048 final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x Gibco 11140050 final concentration 1x
Components of Complete induction media
Compound E Calbiochem 565790 final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO
Doxycycline Sigma D9891 final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS
Induction base media final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632 Fisher Scientific BD 562822 final concentration 10 μM
Components of Neuron media
B-27 Plus Neuronal Culture System Gibco A3653401 final concentration 1x for media and suplemment
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
N2 supplement, 100x Gibco 17502-048 final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x Gibco 11140050 final concentration 1x
iPSC lines used in this study
KOLF2.1J: WT clone B03 The Jackson Laboratories
WTC11 hNIL National Institute of Health
Synaptosome isolation reagents
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific Pierce 23227
dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent Thermo Scientific 87793 Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes
Phagocytosis assay dyes
NucBlue Live Ready reagent Invitrogen  R37605
pHrodo Red, succinimidyl ester ThermoFisher Scientific  P36600 Referred as to pH-sensitive dye
Other cell-culture reagents
Trypan Blue, 0.4% Solution AMRESCO INC K940-100ML
Bovine serum albumin (BSA) Sigma 22144-77-0
BrdU Sigma B9285 Reconstitute to 40 mM in sterile water
Cytochalasin D Sigma final concentration 10 µM
DPBS with Calcium and magnesium Corning 21-030-CV
DPBS without calcium and magnesium Corning 21-031-CV Referred as to DPBS
KnockOut  DMEM/F-12 Gibco 12660012 Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells
Laminin Mouse Protein, Natural Gibco 23017015 Referred as to laminin
Software and Equipment
Centrifuge Eppendorf Model 5810R
Cytation 5 live cell imaging reader Biotek
Gen5 Microplate Reader and Imager Software Biotek version 3.03
Multi-Therm Heat-Shake Benchmark refer as tube shaker
Water sonicator Elma Mode Transsonic 310

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Funes, S., Bosco, D. A. Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes. J. Vis. Exp. (186), e64323, doi:10.3791/64323 (2022).

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