Summary

الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية: التمايز عن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ومقايسة البلعمة في الخلايا الحية في المختبر باستخدام المشبك البشري

Published: August 18, 2022
doi:

Summary

يصف هذا البروتوكول عملية تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSCs) إلى خلايا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة لإجراء التجارب في المختبر . نقوم أيضا بتضمين إجراء مفصل لتوليد المشابك البشرية من الخلايا العصبية الحركية السفلية المشتقة من iPSC والتي يمكن استخدامها كركيزة لفحوصات البلعمة في المختبر باستخدام أنظمة تصوير الخلايا الحية.

Abstract

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية المقيمة من أصل نخاعي تحافظ على التوازن في البيئة الدقيقة للدماغ وأصبحت لاعبا رئيسيا في العديد من الأمراض العصبية. تمثل دراسة الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية في مجال الصحة والمرض تحديا بسبب الإمداد المحدود للغاية بالخلايا البشرية. يمكن استخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) المشتقة من الأفراد البشريين للتحايل على هذا الحاجز. هنا ، يتم توضيح كيفية التمييز بين iPSCs البشرية إلى خلايا تشبه الخلايا الدبقية الصغيرة (iMGs) للتجارب في المختبر . تظهر هذه الخلايا الجذعية المستغلة الخصائص المتوقعة والفسيولوجية للخلايا الدبقية الصغيرة، بما في ذلك التشكل الشبيه بالخلايا الدبقية الصغيرة، والتعبير عن العلامات المناسبة، والبلعمة النشطة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير وثائق لعزل ووضع العلامات على ركائز متشابكة مشتقة من الخلايا العصبية الحركية السفلية المشتقة من iPSC البشرية (i3LMNs). يتم استخدام اختبار التصوير الطولي للخلايا الحية لمراقبة ابتلاع المشابك البشرية الموسومة بصبغة حساسة للأس الهيدروجيني ، مما يسمح بإجراء تحقيقات في قدرة البلعمة في iMG. تنطبق البروتوكولات الموصوفة هنا على نطاق واسع على المجالات المختلفة التي تبحث في بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية ومساهمة الخلايا الدبقية الصغيرة في المرض.

Introduction

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا المناعية المقيمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتلعب دورا مهما في تطوير الجهاز العصبي المركزي. الخلايا الدبقية الصغيرة مهمة أيضا في دماغ البالغين للحفاظ على التوازن والاستجابة بنشاط لعمليات الصدمات والأمراض. تظهر الأدلة التراكمية أن الخلايا الدبقية الصغيرة هي المساهمين الرئيسيين في التسبب في العديد من الأمراض العصبية النمائية والتنكسية العصبية 1,2. على الرغم من أن المعرفة الحالية حول بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة قد تم اشتقاقها في الغالب من نماذج الفئران ، فقد أوضحت الدراسات الحديثة اختلافات مهمة بين الفئران والخلايا الدبقية الصغيرة البشرية ، مما يؤكد الحاجة إلى تطوير تقنيات لدراسة الوظائف الوراثية والبيولوجية للخلايا الدبقية الصغيرة البشرية 3,4. يمكن أن يؤدي عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الأنسجة الأولية المشرحة إلى تعديل خصائص الخلايا الدبقية الصغيرةبشدة 5 ، مما قد يؤدي إلى نتائج مربكة تم الحصول عليها باستخدام هذه الخلايا. الهدف العام من هذه الطريقة هو التمييز بين iPSCs البشرية إلى iMGs ، وبالتالي توفير نظام زراعة الخلايا لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية في ظل الظروف القاعدية. علاوة على ذلك ، يتم تضمين اختبار البلعمة باستخدام نظام نموذج بشري بالكامل هنا كوسيلة لدراسة وظائف iMGs ، كإجراء لمراقبة الجودة وتقييم الخلل الوظيفي في iMG في سياق المرض.

ظهرت مؤخرا بروتوكولات متعددة لتمايز الخلايا الدبقية الصغيرة من iPSCs في الأدبيات6،7،8،9،10. تشمل العيوب المحتملة لبعض البروتوكولات فترات التمايز الممتدة أو الطويلة ، وإضافة عوامل نمو متعددة ، و / أو الإجراءات التجريبية المعقدة6،9،10. هنا ، يتم توضيح طريقة تمايز “سهلة الاستخدام” تلخص جوانب تطور الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال تمايز iPSCs إلى خلايا سلائف تسمى سلائف البلاعم البدائية (PMPs)7,11. يتم إنشاء PMPs كما هو موضح سابقا ، مع بعض التحسينات المقدمة هنا12. تحاكي PMPs الضامة المشتقة من كيس الصفار المستقل عن MYB ، والتي تؤدي إلى ظهور الخلايا الدبقية الصغيرة أثناء التطور الجنيني عن طريق غزو الدماغ قبل إغلاق حاجز الدم في الدماغ13. للتمييز النهائي بين PMPs و iMGs ، استخدمنا طريقة زراعة أحادية سريعة ومبسطة تعتمد على بروتوكولات Haenseler et al. و Brownjohn et al. ، مع بعض التعديلات لتوليد طريقة تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة الفعالة التي تعبر فيها iMGs بقوة عن علامات الخلايا الدبقية الصغيرةالمخصبة 7,8. يمكن استنساخ طريقة التمايز هذه في المختبرات ذات الخبرة في ثقافة iPSCs ومع أهداف بحثية تهدف إلى دراسة بيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام نظام نموذج بشري.

تمثل الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPSC مصدرا ذا صلة بيولوجيا للخلايا الدبقية الصغيرة البشرية لإجراء التجارب في المختبر وهي أداة مهمة للتحقيق في الوظائف الكنسية للخلايا الدبقية الصغيرة ، بما في ذلك البلعمة. الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا البلعمية المهنية في الدماغ والجهاز العصبي المركزي، حيث تزيل حطام الخلايا، والبروتينات المجمعة، والمايلين14 المتحلل. تعمل الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا في إعادة تشكيل متشابك عن طريق ابتلاع نقاط الاشتباك العصبي وفي الدفاع ضد الالتهابات الخارجية من خلال البلعمة من مسببات الأمراض15,16. في هذا البروتوكول ، يتم تقييم البلعمة بواسطة iMGs باستخدام المشابك البشرية كمواد لابتلاع iMG. تحقيقا لهذه الغاية ، تم وصف وصف لعزل التشابك العصبي المشتق من الإنسان i3LMNs. يتم تمييز المشابك البشرية المشتقة من i3LMN بصبغة حساسة للأس الهيدروجيني تسمح بتحديد كمية التشابك العصبي المترجمة داخل المقصورات الحمضية أثناء معالجة البلعمة وتدهورها في المختبر. يظهر اختبار البلعمة باستخدام الفحص المجهري للخلايا الحية لمراقبة العملية الديناميكية لابتلاع الخلايا الدبقية الصغيرة في الوقت الفعلي. يضع هذا الفحص الوظيفي أساسا للتحقيق في العيوب المحتملة في البلعمة الدبقية الصغيرة في الصحة والمرض باستخدام نظام بشري كامل.

Protocol

ملاحظة: يجب أن تكون جميع الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول معقمة، ويجب تنفيذ جميع الخطوات في خزانة السلامة البيولوجية في ظل ظروف معقمة. يتم وصف جميع خطوط iPSC ، بالإضافة إلى وسائط الصيانة والتمايز ، في جدول المواد. تعتمد طريقة تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة الموضحة أدناه على البر?…

Representative Results

لإنشاء iMGs باستخدام هذا البروتوكول ، من المهم البدء ب iPSCs غير المتمايزة التي تظهر مورفولوجيا مستعمرة مدمجة ذات حواف محددة جيدا (الشكل 2 أ). ستشكل iPSCs المنفصلة التي يتم الاحتفاظ بها كما هو موضح في قسم تكوين EB مجاميع كروية ، تسمى EBs ، والتي ستنمو في الحجم حتى اليوم 4 من التمايز (<stro…

Discussion

يوفر بروتوكول التمايز الموصوف هنا طريقة فعالة للحصول على خلايا شبيهة بالخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من iPSC في ~ 6-8 أسابيع بنقاوة عالية وفي عائد كاف لإجراء تجارب التألق المناعي والمقايسات الأخرى التي تتطلب عددا أكبر من الخلايا. وقد أسفر هذا البروتوكول عن 1 × 106 iMGs في أسبوع واحد ، مما ي…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون مايكل وارد على توفير خط WTC11 hNIL iPSC لتمايز الخلايا العصبية الحركية ومختبرات جاكسون لتزويد خط KOLF2.1J WT clone B03 iPSC المستخدم في تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة. كما نشكر دوروثي شافر على دعمها أثناء تنفيذ البروتوكولات ، وأنتوني جيامبيتروزي وجون لاندرز لمساعدتهم في نظام التصوير بالخلايا الحية وكذلك هايدن جاد لمساهماته الفنية أثناء المراجعات وجوناثان جونغ لتعاونه في هذه الدراسة. تم دعم هذا العمل من قبل صندوق دان وديان ريتشيو لعلم الأعصاب من كلية الطب UMASS Chan و Angel Fund، Inc.

Materials

Antibodies for immunofluorescence analysis
anti-IBA1 rabbit antibody Wako Chemical USA NC9288364 1:350 dilution
anti-P2RY12 rabbit antibody Sigma-Aldrich HPA014518 1:50 dilution
anti-TMEM119 rabbit antibody Sigma-Aldrich HPA051870 1:100 dilution
Antibodies for Western blot analysis
anti-β-Tubulin rabbit antibody Abcam ab6046 1:500 dilution
anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody Abclonal A6344 1:1,000 dilution
anti-PSD95 mouse antibody Millipore MAB1596 1:500 dilution
Borate buffer components
Boric acid (100 mM) Sigma B6768
Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (75 mM) Sigma  S7653
Sodium tetraborate (25 mM) Sigma 221732
Cell culture materials
6-well plates Greiner Bio-One 657160
40 μm Cell Strainers  Falcon 352340
100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated CELLTREAT 229620
Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile CELLTREAT 229305
low adherence round-bottom 96-well plate Corning 7007
Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate Corning 353847,
Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate Corning 353846
Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate Corning 353872
Cell dissociation reagents
Accutase  Corning 25058CI dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation
TrypLE reagent Life Technologies 12-605-010 dissociation reagents used for microglia differentiation
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020
Coating reagents for cell culture
Matrigel GFR Membrane Matrix Corning™ 354230 Referred as to extracellular matrix coating reagent
CellAdhere Laminin-521 STEMCELL Technology 77004 Referred as to laminin 521
Poly-D-Lysine Sigma P7405 Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer
Poly-L-Ornithine Sigma  P3655 Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer
Components of iPSC media
 mTeSR Plus Kit STEMCELL Technology 100-0276 To prepare iPSC media mixed the components to 1x
Components of EB media
BMP-4 Fisher Scientific PHC9534 final concentration 50 ng/mL
iPSC media final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632 Fisher Scientific BD 562822 final concentration 10 µM
SCF PeproTech 300-07 final concentration 20 ng/mL
VEGF PeproTech 100-20A final concentration 50 ng/mL
Components of PMP base media
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122 final concentration 100 U/mL
X-VIVO 15 Lonza 12001-988 final concentration 1x
Components of PMP complete media
55 mM 2-mercaptoethanol Gibco 21985023 final concentration 55 µM
IL-3 PeproTech 200-03 final concentration 25 ng/mL
M-CSF PeproTech 300-25 final concentration 100 ng/mL
PMP base media final concentration 1x
Components of iMG base media
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634010 final concentration 1x
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
N2 supplement, 100x Gibco 17502-048 final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122 final concentration 100 U/mL
Components of iMG complete media
55 mM 2-mercaptoethanol Gibco 21985023 final concentration 55 µM
IL-34 PeproTech or Biologend 200-34 or 577904 final concentration 100 ng/mL
iMG base media final concentration 1x
M-CSF PeproTech 300-25 final concentration 5 ng/mL
TGF-β PeproTech 100-21 final concentration 50 ng/mL
Components of Induction base media
DMEM/F12 with HEPES Gibco 11330032 final concentration 1x
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
N2 supplement, 100x Gibco 17502-048 final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x Gibco 11140050 final concentration 1x
Components of Complete induction media
Compound E Calbiochem 565790 final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO
Doxycycline Sigma D9891 final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS
Induction base media final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632 Fisher Scientific BD 562822 final concentration 10 μM
Components of Neuron media
B-27 Plus Neuronal Culture System Gibco A3653401 final concentration 1x for media and suplemment
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
N2 supplement, 100x Gibco 17502-048 final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x Gibco 11140050 final concentration 1x
iPSC lines used in this study
KOLF2.1J: WT clone B03 The Jackson Laboratories
WTC11 hNIL National Institute of Health
Synaptosome isolation reagents
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific Pierce 23227
dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent Thermo Scientific 87793 Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes
Phagocytosis assay dyes
NucBlue Live Ready reagent Invitrogen  R37605
pHrodo Red, succinimidyl ester ThermoFisher Scientific  P36600 Referred as to pH-sensitive dye
Other cell-culture reagents
Trypan Blue, 0.4% Solution AMRESCO INC K940-100ML
Bovine serum albumin (BSA) Sigma 22144-77-0
BrdU Sigma B9285 Reconstitute to 40 mM in sterile water
Cytochalasin D Sigma final concentration 10 µM
DPBS with Calcium and magnesium Corning 21-030-CV
DPBS without calcium and magnesium Corning 21-031-CV Referred as to DPBS
KnockOut  DMEM/F-12 Gibco 12660012 Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells
Laminin Mouse Protein, Natural Gibco 23017015 Referred as to laminin
Software and Equipment
Centrifuge Eppendorf Model 5810R
Cytation 5 live cell imaging reader Biotek
Gen5 Microplate Reader and Imager Software Biotek version 3.03
Multi-Therm Heat-Shake Benchmark refer as tube shaker
Water sonicator Elma Mode Transsonic 310

Riferimenti

  1. Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254 (2021).
  2. Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065 (2021).
  3. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  4. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  5. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  6. Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  7. Brownjohn, P. W., et al. Functional studies of missense TREM2 mutations in human stem cell-derived microglia. Stem Cell Reports. 10 (4), 1294-1307 (2018).
  8. Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
  9. McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
  10. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  11. Haenseler, W., Rajendran, L. Concise review: modeling neurodegenerative diseases with human pluripotent stem cell-derived microglia. Stem Cells. 37 (6), 724-730 (2019).
  12. Wilgenburg, B. v., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PloS One. 8 (8), 71098 (2013).
  13. Hoeffel, G., Ginhoux, F. Ontogeny of tissue-resident macrophages. Frontiers in Immunology. 6, 486 (2015).
  14. Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson’s disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144 (2018).
  15. Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545 (2015).
  16. Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138 (2014).
  17. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51 (2018).
  18. Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808 (2020).
  19. Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
  20. Schmidt, E. J., et al. ALS-linked PFN1 variants exhibit loss and gain of functions in the context of formin-induced actin polymerization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (23), (2021).
  21. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).

Play Video

Citazione di questo articolo
Funes, S., Bosco, D. A. Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes. J. Vis. Exp. (186), e64323, doi:10.3791/64323 (2022).

View Video