通过非侵入性经鼻途径在免疫功能正常的小鼠大脑中移植人诱导的多能干细胞衍生小胶质细胞

本研究中使用的所有动物都是根据日本生理学会20出版的“生理学科学领域动物护理和使用指导原则”以及山梨大学动物护理委员会的先前批准获得的，饲养，护理和使用。 日本）。 1.细胞培养基、移植培养基、麻醉混合物的制备 通过在DMEM中加入10%胎牛血清和0.1%青霉素/链霉素来制备细胞培养基。 通过在细胞培养基中加入hCSF1（250ng / mL）和hTGF-β1（100 ng / mL）来制备移植培养基。 通过将0.45mL盐酸美托咪定，1.2mL咪达唑仑和1.5mL酒石酸丁呥酚与11.8mL生理盐水中混合，制备腹膜内注射的麻醉混合物。 2. iPSMG的制备 注意：冷冻的iPSMG（材料表）保持在-80°C直至使用。 在37°C水浴中快速解冻冷冻的细胞。旋转样品，直到所有可见的冰都融化。 将解冻的iPSMG加入加热至37°C的培养基中。 向10mL培养基中加入1mL含有培养基（1×106 个细胞）的解冻细胞。 将细胞以300× g 离心5分钟以获得细胞沉淀。 离心后，除去所有上清液而不干扰细胞沉淀。完全去除上清液是可取的，以减少移植培养基中细胞因子浓度的稀释。 加入移植培养基以获得1 x 105 个细胞/ μL的细胞浓度。 将iPSMG放在冰上，然后立即进行移植。注意：用于移植的iPSMG的制备是在干净的工作台上进行的，以避免污染。 3. 小鼠经鼻移植的制备（Tsn） 用含有PLX5622的饮食喂养野生型雄性小鼠（C57BL / 6J，8周龄）7天。 在第7天结束时，停止PLX饮食，并以正常饮食喂养小鼠，直到研究结束。注意：含PLX5622的日粮是在1公斤AIN-93G（材料表）中加入1.2克PLX5622来制备的。 4. 细胞经鼻移植 停止PLX喂养后24小时，称量小鼠并使用腹膜内注射麻醉混合物（0.2mL / 20g）麻醉它们。 在通过对踏板戒断反射无反应（坚实的脚趾夹）评估小鼠完全麻醉后，在iPSMG的Tsn到每个鼻孔之前1小时在PBS（100 U / mL）中施用2.5μL透明质酸酶，以使用10μL移液器尖端两次以增加鼻粘膜的通透性。 施用透明质酸酶后，将小鼠置于仰卧位。 在iPSMG经鼻移植前10分钟重复步骤4.2。 使用10μL移液器吸头将2.5μL细胞悬浮液施用于小鼠的一个鼻孔。 将小鼠置于仰卧位5分钟，然后将细胞悬浮液施用于另一个鼻孔。 重复步骤4.5和4.6四次，每只动物的总体积为20μL。 将小鼠置于37°C热垫上的仰卧位，直到从麻醉中恢复。 在停止PLX喂养后48小时，再次在同一只小鼠上重复步骤4.1-4.7。注意：应该注意的是，iPSMG在移植过程中被放置在冰上。 5. 细胞因子的应用 通过腹膜内注射麻醉混合物（0.2mL / 20g）麻醉小鼠。 使用10μL移液器尖端将2.5μL移植培养基施加到小鼠的一个鼻孔中。 将小鼠置于仰卧位5分钟，然后将移植培养基施用于另一个鼻孔。 重复步骤5.2和5.3四次，每只动物的总体积为20μL。注意：应该注意的是，移植培养基（人细胞因子）的经鼻给药需要每12小时一次，以使移植的iPSMG的活力直到研究结束。