비침습적 경비강 경로를 통한 면역적격 마우스 뇌에서 인간 유도 만능 줄기세포 유래 미세아교세포의 이식

이 연구에 사용 된 모든 동물은 일본 생리학 학회20에서 발표 한 “생리 과학 분야의 동물 관리 및 사용에 관한 지침 원칙”과 야마나시 대학 동물 관리위원회 (야마나시, 일본). 1. 세포 배지, 이식 배지 및 마취 혼합물의 제조 DMEM에 10% 소 태아 혈청과 0.1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하여 세포 배지를 준비합니다. 세포 배지에 hCSF1 (250 ng/mL) 및 hTGF-β1 (100 ng/mL)을 첨가하여 이식 배지를 준비하십시오. 정상 식염수 11.8 mL에 메데토미딘 염산염 0.45 mL, 미다졸람 1.2 mL, 부토르파놀 타르트레이트 1.5 mL를 혼합하여 복강내 주사를 위한 마취 혼합물을 제조하였다. 2. iPSMG의 제조 참고: 냉동 iPSMG (표 물질)는 사용 전까지 -80°C에서 유지하였다. 동결된 세포를 37°C 수조에서 빠르게 해동시킨다. 보이는 모든 얼음이 녹을 때까지 샘플을 소용돌이치십시오. 해동된 iPSMG를 37°C로 가온된 배양 배지에 첨가한다. 해동된 세포 함유 배지 1 mL(1 × 106 세포)를 배양 배지 10 mL에 첨가한다. 세포를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 얻었다. 원심분리 후, 세포 펠릿을 방해하지 않고 모든 상층액을 제거한다. 상청액의 완전한 제거는 이식 배지 내의 사이토카인 농도의 희석을 감소시키는 것이 바람직하다. 이식 배지를 추가하여 1 x 10 5 cells/μL의 세포 농도를 얻습니다. iPSMG를 얼음 위에 놓고 즉시 이식을 진행하십시오.참고 : 이식을위한 iPSMG의 준비는 오염을 피하기 위해 깨끗한 벤치에서 수행됩니다. 3. 경비강 이식용 마우스(Tsn)의 제조 야생형 수컷 마우스(C57BL/6J, 8주령)에게 PLX5622가 함유된 사료를 7일 동안 먹이십시오. 7일이 끝나면 PLX 식단을 중단하고 연구가 끝날 때까지 정상적인 식단으로 마우스에게 먹이를줍니다.참고: 식단을 함유한 PLX5622는 AIN-93G 1kg에 PLX5622 1.2g을 첨가하여 제조됩니다(재료 표). 4. 세포의 경비강 이식 PLX 공급의 중단 24시간 후, 마우스를 칭량하고 마취 혼합물(0.2 mL/20 g)의 복강내 주사를 사용하여 마취한다. 마우스를 페달 금단 반사 (확고한 발가락 핀치)에 대한 무반응으로 평가한 바와 같이 완전히 마취시킨 후, iPSMG의 Tsn을 1 h 전에 PBS (100 U/mL)에 히알루로니다아제 2.5 μL를 10 μL 피펫 팁을 사용하여 각 콧구멍에 2회 투여하여 비강 점막의 투과성을 증가시킨다. 히알루로니다아제를 적용한 후, 마우스를 수핀 위치에 놓습니다. iPSMG의 경비강 이식 10분 전에 단계 4.2를 반복한다. 2.5 μL의 세포 현탁액을 10 μL 피펫 팁을 사용하여 마우스의 하나의 콧구멍에 도포한다. 세포 현탁액을 다른 콧구멍에 투여하기 전에 5분 동안 마우스를 수핀 위치에 놓는다. 단계 4.5 및 4.6을 4회 반복하고, 동물 당 20 μL의 총 부피를 적용한다. 마우스를 마취로부터 회복될 때까지 37°C 히트 패드 상의 수핀 위치에 놓는다. PLX 공급의 중단 후 48 h에서, 동일한 마우스에서 단계 4.1-4.7을 다시 한번 반복한다.참고 : iPSMG는 이식 중에 얼음 위에 놓여진다는 점에 유의해야합니다. 5. 사이토카인의 적용 마취 혼합물 (0.2 mL / 20 g)의 복강 내 주사로 마우스를 마취하십시오. 2.5 μL의 이식 배지를 10 μL 피펫 팁을 사용하여 마우스의 한쪽 콧구멍에 도포한다. 이식 배지를 다른 콧구멍에 투여하기 전에 마우스를 5분 동안 수핀 위치에 놓는다. 단계 5.2 및 5.3을 네 번 반복하고, 동물 당 20 μL의 총 부피를 적용한다.참고: 이식 배지 (인간 사이토카인)의 경비강 투여는 연구가 끝날 때까지 이식된 iPSMG의 생존력을 위해 매 12시간마다 필요하다는 점에 유의해야 한다.