Vengono descritti metodi sperimentali per raccogliere cellule staminali adulte da tessuti intestinali ed epatici canini per stabilire colture organoidi 3D. Inoltre, vengono discusse le tecniche di laboratorio per garantire una crescita costante e fornire procedure operative standard per raccogliere, biobancare e far rivivere colture organoidi intestinali ed epatiche canine.
I cani sviluppano malattie multifattoriali complesse analoghe agli esseri umani, tra cui malattie infiammatorie, malattie metaboliche e cancro. Pertanto, rappresentano modelli animali di grandi dimensioni rilevanti con il potenziale traslazionale della medicina umana. Gli organoidi sono strutture 3-dimensionali (3D), auto-assemblate derivate da cellule staminali che imitano la microanatomia e la fisiologia del loro organo di origine. Questi modelli traslazionali in vitro possono essere utilizzati per applicazioni di permeabilità e scoperta di farmaci, valutazione tossicologica e per fornire una comprensione meccanicistica della fisiopatologia delle malattie croniche multifattoriali. Inoltre, gli organoidi canini possono migliorare la vita dei cani da compagnia, fornendo input in varie aree della ricerca veterinaria e facilitando applicazioni di trattamento personalizzate in medicina veterinaria. Un piccolo gruppo di donatori può creare una biobanca di campioni di organoidi, riducendo la necessità di una raccolta continua di tessuti, poiché le linee cellulari organoidi possono essere sottocolturate a tempo indeterminato. Qui vengono presentati tre protocolli che si concentrano sulla coltura di organoidi canini intestinali ed epatici derivati da cellule staminali adulte. Il Canine Organoid Isolation Protocol delinea i metodi per elaborare il tessuto e l’incorporamento dell’isolato cellulare in una matrice di supporto (matrice di membrana extracellulare solubilizzata). Il canino Organoid Maintenance Protocol descrive la crescita e la manutenzione degli organoidi, compresa la pulizia e il passaggio insieme ai tempi appropriati per l’espansione. L’Organoid Harvesting and Biobanking Protocol descrive i modi per estrarre, congelare e conservare gli organoidi per ulteriori analisi.
I roditori sono il modello animale più comunemente utilizzato per la ricerca biomedica e traslazionale1. Sono eccezionalmente utili per studiare la patogenesi molecolare di base delle malattie, sebbene la loro rilevanza clinica per le malattie croniche multifattoriali sia stata recentemente messa in discussione2. Il modello canino presenta diversi vantaggi rispetto ai roditori3,4. Cani e umani condividono somiglianze nella metabolomica e nel microbioma intestinale che si sono sviluppati a causa del consumo di dieta umana durante vari periodi della loro domesticazione5,6,7. Le somiglianze tra anatomia e fisiologia gastrointestinale canina e umana sono un altro degli esempi8.
Inoltre, i cani spesso condividono ambienti e stili di vita simili con i loro proprietari9. La maggiore durata della vita dei cani rispetto ai roditori consente lo sviluppo naturale di numerose condizioni croniche10. La malattia infiammatoria intestinale o la sindrome metabolica sono esempi di malattie croniche multifattoriali che condividono importanti somiglianze tra esseri umani e cani11,12. Gli studi preclinici canini che coinvolgono cani con malattie naturali possono generare dati più affidabili di quelli ottenuti dai modelli di roditori13. Tuttavia, per ridurre al minimo l’uso della ricerca sugli animali vivi e rispettare i principi delle 3R (Ridurre, Raffinare, Sostituire)14, sono emerse alternative ai test in vivo che utilizzano organoidi canini 3D di vitro15.
Gli organoidi sono strutture derivate da cellule staminali 3D autoassemblate che ricapitolano la fisiologia e la microanatomia dei loro organi originali16,17. Questa tecnologia è stata descritta per la prima volta da Sato et al. nel 200917 e ha permesso studi in vitro più traducibili in linee cellulari epiteliali di quanto fosse possibile in precedenza utilizzando colture di cellule tumorali 2D18,19,20. Gli organoidi sono modelli utili in vitro in molte discipline biomediche come negli studi tossicologici preclinici21,22,23, di assorbimento o sul metabolismo24,25,26,27,28, nonché in approcci medici personalizzati29,30,31 . La coltura di successo di organoidi intestinali canini è stata descritta per la prima volta nel 201912, mentre gli organoidi epatici derivati da un cane sono stati segnalati per la prima volta da Nantasanti et al. nel 201532. Da allora gli organoidi canini sono stati utilizzati con successo in studi che studiano enteropatie croniche canine, tumori stromali gastrointestinali, adenocarcinoma colorettale12 e malattia di Wilson33,34.
Mentre le cellule staminali adulte possono essere raccolte tramite necropsie, la tecnologia organoide non richiede sempre il sacrificio degli animali. Le biopsie endoscopiche e laparoscopiche, o anche gli aspirati con ago sottile degli organi35, sono una valida fonte di cellule staminali adulte per l’isolamento degli organoidi epiteliali12. L’uso diffuso di tali tecniche non invasive nella pratica veterinaria facilita le opzioni per la ricerca traslazionale inversa (traduzione di informazioni dalla pratica clinica veterinaria alla pratica clinica umana e viceversa)15. Un ulteriore progresso della tecnologia degli organoidi può essere garantito dalla standardizzazione dei metodi di coltura e manutenzione degli organoidi. Il protocollo organoide qui presentato è parzialmente basato sul lavoro precedentemente pubblicato di Saxena et al. dal 201536 e i metodi sono stati adattati per adattarsi alle specifiche della coltura organoide intestinale ed epatica canina. Il flusso di lavoro complessivo dei protocolli organoidi canini è illustrato nella Figura 1.
Il protocollo di isolamento degli organoidi canini introduce metodi per ottenere campioni da biopsie endoscopiche, laparoscopiche e chirurgiche, nonché necropsie. Delinea il pretrattamento iniziale dei campioni di tessuto e le metodologie utilizzate per il trasporto in laboratorio. I materiali e i reagenti necessari per l’isolamento organoide sono riassunti nella sezione “Preparazione per l’isolamento”. Il processo di isolamento delle cellule staminali adulte dai campioni di tessuto è ulteriormente descritto in dettaglio. Infine, viene discusso il processo di placcatura degli organoidi in strutture a cupola utilizzando una matrice di membrana extracellulare solubilizzata.
Il secondo protocollo, Canine Organoid Maintenance Protocol, descrive i metodi di documentazione e coltura degli organoidi. I cambiamenti dei media e la loro frequenza sono discussi in questa sezione. Inoltre, vengono descritte le procedure di laboratorio come il passaggio e la pulizia delle colture cellulari, essenziali per garantire il corretto mantenimento degli organoidi canini 3D. Il passaggio appropriato è un passaggio critico del protocollo e le possibili regolazioni e la risoluzione dei problemi di questo passaggio sono discussi ulteriormente nel manoscritto.
L’ultimo protocollo è Canine Organoid Harvesting and Biobanking Protocol contenente metodi per la preparazione di organoidi adulti per l’incorporamento di paraffina e la conservazione dell’RNA. Qui vengono descritti anche i metodi di biobanking dei campioni organoidi nello stoccaggio dell’azoto liquido. Infine, vengono discussi i modi per scongelare i campioni congelati e sostenere la loro crescita.
In conclusione, questo articolo mira a fornire procedure coerenti di coltura di organoidi canini attraverso la standardizzazione di protocolli inter-laboratorio. In tal modo, il manoscritto mira a facilitare la riproducibilità dei dati derivati da modelli organoidi canini per aumentare la loro rilevanza nella ricerca biomedica traslazionale.
Figura 1: Flusso di lavoro dei protocolli organoidi canini. Il Canine Organoid Isolation Protocol descrive la preparazione dei materiali necessari per l’isolamento organoide, la raccolta di un campione di tessuto (attraverso necropsie, biopsie endoscopiche, laparoscopiche e chirurgiche) e le linee guida sulla dissociazione cellulare e la placcatura della popolazione cellulare. Il Canine Organoid Maintenance Protocol discute la pulizia e il passaggio della coltura organoide. L’Organoid Harvesting and Biobanking Protocol discute la preparazione di campioni organoidi per l’incorporamento di paraffina e un’ulteriore caratterizzazione degli organoidi. Vengono inoltre discussi i metodi per biobancare le colture organoidi e farle rivivere dallo stoccaggio in azoto liquido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Attualmente mancano protocolli standardizzati per l’isolamento e il mantenimento degli organoidi epatici e intestinali canini. È necessario stabilire procedure operative standard per le colture organoidi affinché questo modello sia applicabile in diversi ambienti di laboratorio. In particolare, fornire protocolli operativi standardizzati per la coltura di questi modelli di organoidi canini è la chiave per caratterizzare la normale crescita degli organoidi durante la coltura e il passaggio per ricavare punti temporali ottimali per l’espansione e la manutenzione. Gli organoidi intestinali canini coltivati utilizzando il protocollo sono stati precedentemente caratterizzati da Chandra et al.12.
Uno dei passaggi più critici del protocollo è il passaggio degli organoidi. Il momento ottimale per il primo passaggio degli sferoidi epatici è stato determinato il giorno 7 dopo l’isolamento in base alle misurazioni dello sferoide epatico. Il volume massimo di sferoidi è stato raggiunto entro il giorno 7 e, allo stesso tempo, gli sferoidi hanno iniziato a germogliare e formare organoidi epatici. L’aumento del volume complessivo degli organoidi dal giorno 2-7 dopo l’isolamento è stato di oltre 365 volte, suggerendo che il tempo di passaggio ottimale è più lungo della coltura di organoidi intestinali canini. Dopo 7 giorni in coltura, non sono stati osservati segni grossolani di apoptosi cellulare nello sferoide epatico, anche senza pulizia o passaggio (Figura 7). Il passaggio degli organoidi intestinali ed epatici può essere impegnativo in quanto la procedura può portare alla perdita di cellule e all’alterazione della vitalità. I risultati indicano che l’incubazione prolungata di organoidi epatici con proteasi simile alla tripsina (fino a 12 min) non influenza negativamente la sottocoltura. L’incubazione degli organoidi in proteasi simile alla tripsina per più di 24 minuti può essere dannosa per la successiva sottocoltura degli organoidi.
In caso di rottura non ottimale nei cluster cellulari con il passaggio organoide, la dissociazione meccanica invece dell’incubazione prolungata con proteasi simile alla tripsina potrebbe essere più vantaggiosa. Se si riscontrano problemi con una corretta dissociazione degli organoidi, si può tentare di allungare brevemente i campioni per migliorare la resa di passaggio. D’altra parte, il vortice ha il potenziale per rovinare una coltura e danneggiare le cellule, quindi dovrebbe essere usato solo quando altre procedure hanno fallito ripetutamente. Rompere gli organoidi epatici in singole cellule abbassa il tasso di crescita degli organoidi, mentre romperli in gruppi di cellule può migliorare notevolmente la loro vitalità. Dieci minuti sono stati scelti come tempo di incubazione per il protocollo organoide. Un timepoint di incubazione di 12 minuti è stato ritenuto non citotossico rispetto a un’incubazione di 24 minuti nell’esperimento di proteasi simile alla tripsina.
L’esperimento di sopravvivenza ha confermato che gli organoidi epatici canini potrebbero sopravvivere fino a 19,5 giorni in condizioni sfavorevoli (esaurimento strutturale e nutrizionale). Gli organoidi che sono sopravvissuti a queste condizioni più a lungo sono stati coltivati con mezzi CMGF +. Questa osservazione potrebbe essere stata causata dalla crescita più lenta di organoidi epatici in mezzi non integrati con inibitore di Rock e GSK3β. Le colture organoidiche con CMGF+ R/G sono cresciute più velocemente e potrebbero aver esaurito le loro risorse più velocemente. Questo esperimento apre la possibilità di miniaturizzare la coltura di organoidi canini per ottenere una conversione del sistema ad alto rendimento. Tale tecnologia mostra il potenziale per facilitare la scoperta di farmaci o studi tossicologici a un costo sostanzialmente ridotto.
Alcuni problemi comuni riscontrati durante la manutenzione della coltura organoide canina sono la solidificazione impropria del campione durante la placcatura, la contaminazione della coltura e la determinazione della corretta densità e dimensione degli organoidi. Se l’ECM solubilizzato si solidifica prematuramente durante la placcatura, metterlo immediatamente sul ghiaccio per 10 minuti. Se l’ECM solubilizzato non forma strutture a cupola, è probabile che non siano stati rimossi abbastanza mezzi dal campione. In questo caso, diluire il campione con un ECM più solubilizzato fino a formare delle cupole.
Quando la contaminazione fungina o batterica si trova in un’intera piastra (vedere la Figura 4), la soluzione migliore è scartare la piastra. Il trattamento con farmaci antifungini o antibiotici può essere tentato, ma il successo di tale tentativo è estremamente basso. Se un singolo pozzo è contaminato in una piastra, i pozzi vitali e non interessati possono essere puliti (seguire i passaggi da 4.1 a 4.5) su una nuova piastra e monitorati attentamente. Se il campione è già stato congelato di emergenza, è consigliabile scartare l’intero campione, poiché lo scongelamento del campione espone l’incubatore a un ulteriore rischio di contaminazione.
La coltura di organoidi sani dovrebbe essere almeno nella categoria di medie dimensioni e media densità o superiore. La densità ottimale è fondamentale per la crescita della coltura di organoidi. La densità inferiore deve essere corretta pulendo gli organoidi a media densità. Se si verifica la situazione di densità estrema (sovraffollamento), gli organoidi dovrebbero essere espansi a più pozzi. Segni grossolani di apoptosi cellulare spesso accompagnano sia il sovraffollamento che la bassa densità della coltura organoide. Se questi problemi non vengono corretti in tempo, l’intera coltura organoide diventerà apoptotica nel giro di pochi giorni. Se gli organoidi raggiungono dimensioni extra large o densità molto elevate, la coltura deve essere utilizzata per un esperimento, congelamento o fissazione.
Il mezzo organoide contiene attualmente 17 componenti e l’aggiunta di fattori di crescita necessari per la manutenzione e l’espansione degli organoidi può quindi essere costosa. Questo problema può essere risolto coltivando colture cellulari 2D che sintetizzano i fattori di crescita per produrre CMGF+ condizionato. La coltura cellulare L-WRN produce fattori di crescita Wnt-3a, R-Spondin-3 e Noggin37. La colonia cellulare utilizza il 90% di DMEM/F12 e il 10% di terreni di coltura FBS. Quando la cultura raggiunge il 90% di confluenza, i media vengono raccolti ogni giorno per 1 settimana. Il mezzo raccolto viene quindi miscelato con 2x CMGF+ (senza questi fattori di crescita). Mentre le colture 2D possono produrre i fattori di crescita necessari a una frazione del costo, è necessario prevedere il tempo e la preparazione aggiunti per produrre i supporti. Anche le concentrazioni di fattori di crescita tra lotti di mezzi condizionati possono differire37,38.
Le colture organoidi derivate da cellule staminali adulte canine sono un modello biomedico unico che può aiutare a raggiungere gli obiettivi della One Health Initiative39. La tecnologia organoide può essere utilizzata in molte aree di ricerca di base e biomedica, che vanno dalla biologia dello sviluppo, alla fisiopatologia, alla scoperta e ai test di farmaci, alla tossicologia allo studio delle malattie infettive e alla medicina rigenerativa40. La ricerca traslazionale e traslazionale inversa sono entrambe aree in cui sono applicabili gli organoidi canini15. I cani sono stati usati per secoli in contesti sperimentali traslazionali e il loro status di animale da compagnia ha anche facilitato la loro posizione come una delle specie più esplorate in medicina veterinaria.
In conclusione, questo manoscritto fornisce protocolli operativi standardizzati per l’isolamento, la manutenzione, la raccolta e il biobanking di organoidi epatici e intestinali canini per facilitare l’applicazione di questo modello in vari campi biomedici. Questo modello è particolarmente adatto a promuovere la ricerca traslazionale inversa come strumento dell’iniziativa One Health per promuovere la condivisione interdisciplinare e intradisciplinare delle conoscenze.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori vogliono esprimere gratitudine ai dipendenti del Veterinary Diagnostic Laboratory della Iowa State University, vale a dire, Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victoria J. Green e Jennifer M. Groeltz-Thrush, per la tempestiva elaborazione dei campioni forniti. Gli autori desiderano riconoscere il supporto di Faculty Startup, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award e NSF SBIR sub-award a ISU # 1912948.
Chelating solution | |||
D-Sorbitol | Fisher Chemical | BP439-500 | |
DTT | Promega | V3151 | |
KCl | Fisher Chemical | P217-500 | |
KH2PO4 | Sigma | P5655-100G | |
Na2HPO4-2H2O | Sigma | S5136-100G | |
NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Sucrose | Fisher Chemical | S5-500 | |
Organoid media | |||
[Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
FBS | Corning | 35-010-CV | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
Trimethoprim | Sigma | T7883-5G | |
Sulfamethoxazole | Sigma-Aldrich | S7507-10G | |
Reagents | |||
Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Chemicals | D128-500 | |
EDTA, pH 8.0, 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
RNAlater Soln. | Invitrogen | AM7021 | RNA Storage Reagent |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
Altro | |||
6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
ACD Hybez II Hybridization System | ACD a biotechne brand | 321710 | |
Centrifuge Tube, 15 mL | Corning | 430766 | |
CoolCell LX | Corning | BCS-405MC | |
Cryogenic Vials | Corning | 430488 | |
Disposable Centrifuge Tube (50 mL) | Fisherbrand | 05-539-13 | |
GyroMini Nutating mixer (Rocker) | Labnet | S0500-230V-EU | |
Heat Bath | Lab-Line Instruments | 3000 | |
Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | SpectrophotometerAnalysis |
Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Laboratory Flexible Film Tape |
Protected Disposable Scalpels | Bard-Parker | 239844 | |
RNAscope 2.5 HD Assay – RED | ACD a biotechne brand | 322350 | |
RNAscope H2O2 & Protease Plus Reagents | ACD a biotechne brand | 322330 | |
RNAscope Target Retrieval Reagents | ACD a biotechne brand | 322000 | |
RNAscope Wash Buffer Reagents | ACD a biotechne brand | 310091 | |
Tissue Culture Dish | Dot Scientific | 6676621 | |
Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |