3D organoid kültürler oluşturmak için köpek bağırsak ve hepatik dokularından yetişkin kök hücrelerin toplanması için deneysel yöntemler açıklanmaktadır. Ayrıca, tutarlı büyümeyi sağlamak ve köpek bağırsak ve hepatik organoid kültürlerini toplamak, biyobanka yapmak ve canlandırmak için standart çalışma prosedürleri sağlamak için laboratuvar teknikleri tartışılmaktadır.
Köpekler, enflamatuar hastalıklar, metabolik hastalıklar ve kanser dahil olmak üzere insanlara benzer karmaşık multifaktöriyel hastalıklar geliştirir. Bu nedenle, insan tıbbına çeviri potansiyeline sahip ilgili büyük hayvan modellerini temsil ederler. Organoidler, menşe organlarının mikroanatomisini ve fizyolojisini taklit eden kök hücrelerden türetilen 3 boyutlu (3D), kendiliğinden monte edilmiş yapılardır. Bu translasyonel in vitro modeller, ilaç geçirgenliği ve keşif uygulamaları, toksikoloji değerlendirmesi ve multifaktöriyel kronik hastalıkların patofizyolojisinin mekanik bir şekilde anlaşılmasını sağlamak için kullanılabilir. Ayrıca, köpek organoidleri refakatçi köpeklerin yaşamlarını iyileştirebilir, veterinerlik araştırmalarının çeşitli alanlarında girdi sağlayabilir ve veteriner hekimlikte kişiselleştirilmiş tedavi uygulamalarını kolaylaştırabilir. Küçük bir donör grubu, organoid hücre hatları süresiz olarak alt kültürlenebildiğinden, sürekli doku toplama ihtiyacını azaltan bir organoid numune biyobankası oluşturabilir. Burada, yetişkin kök hücrelerden elde edilen bağırsak ve hepatik köpek organoidlerinin kültürüne odaklanan üç protokol sunulmaktadır. Köpek Organoid İzolasyon Protokolü, dokuyu işlemek ve hücre izolatının destekleyici bir matrise (çözünmüş hücre dışı membran matrisi) gömülmesi için yöntemleri özetlemektedir. Köpek Organoid Bakım Protokolü, genişleme için uygun zamanlama ile birlikte temizlik ve pasaj dahil olmak üzere organoid büyüme ve bakımı tanımlar. Organoid Hasat ve Biyobankacılık Protokolü, daha fazla analiz için organoidleri çıkarmanın, dondurmanın ve korumanın yollarını açıklar.
Kemirgenler, biyomedikal ve translasyonel araştırmalar için en yaygın kullanılan hayvan modelidir1. Kronik multifaktöriyel hastalıklarla klinik ilgileri son zamanlarda sorgulanmasına rağmen, hastalıkların temel moleküler patogenezini araştırmak için son derece yararlıdırlar2. Köpek modeli, kemirgenlere kıyasla çeşitli avantajlar sergiler3,4. Köpekler ve insanlar, evcilleştirmelerinin çeşitli dönemlerinde insan diyetinin tüketilmesi nedeniyle gelişen metabolomikler ve bağırsak mikrobiyomundaki benzerlikleri paylaşırlar5,6,7. Köpek ve insan gastrointestinal anatomisi ve fizyolojisi arasındaki benzerlikler örneklerden bir diğeridir8.
Ek olarak, köpekler genellikle sahipleriyle benzer ortamları ve yaşam tarzlarını paylaşırlar9. Kemirgenlere kıyasla köpeklerin daha uzun ömrü, çok sayıda kronik durumun doğal gelişimine izin verir10. İnflamatuar bağırsak hastalığı veya metabolik sendrom, insanlar ve köpekler arasında önemli benzerlikler paylaşan multifaktöriyel kronik hastalıklara örnektir11,12. Doğal olarak ortaya çıkan hastalıkları olan köpekleri içeren köpek preklinik çalışmaları, kemirgen modellerinden elde edilenlerden daha güvenilir veriler üretebilir13. Bununla birlikte, canlı hayvan araştırmalarının kullanımını en aza indirmek ve 3R’lerin (Azalt, Rafine Et, Değiştir)14 ilkelerine uymak için, 3D in vitro köpek organoidleri kullanılarak yapılan in vivo testlere alternatifler ortaya çıkmıştır15.
Organoidler, orijinal organlarının fizyolojisini ve mikroanatomisini özetleyen, kendi kendine monte edilmiş 3D kök hücre türevi yapılardır16,17. Bu teknoloji ilk olarak 200917 yılında Sato ve ark. tarafından tanımlanmış ve epitel hücre hatlarında 2D kanser hücre kültürleri kullanılarak daha önce mümkün olandan daha fazla translaable in vitro çalışmalara izin vermiştir18,19,20. Organoidler, klinik öncesi toksikolojik21,22,23, emilim veya metabolizma çalışmaları24,25,26,27,28 gibi birçok biyomedikal disiplinde ve kişiselleştirilmiş tıbbi yaklaşımlarda29,30,31 gibi birçok biyomedikal disiplinde in vitro modellerde yararlıdır. . Köpek bağırsak organoidlerinin başarılı kültürü ilk kez 201912’de tanımlanmışken, bir köpekten türetilen hepatik organoidler ilk olarak Nantasanti ve ark. tarafından 201532’de bildirilmiştir. Köpek organoidleri o zamandan beri köpek kronik enteropatilerini, gastrointestinal stromal tümörleri, kolorektal adenokarsinom12 ve Wilson Hastalığını33,34 araştıran çalışmalarda başarıyla kullanılmaktadır.
Yetişkin kök hücreler nekropsiler yoluyla toplanabilirken, organoid teknoloji her zaman hayvanların kurban edilmesini gerektirmez. Endoskopik ve laparoskopik biyopsiler, hatta organların ince iğneli aspiratları35, epitelyal organoid izolasyonu için uygun bir yetişkin kök hücre kaynağıdır12. Bu tür invaziv olmayan tekniklerin veterinerlik pratiğinde yaygın kullanımı, tersine translasyonel araştırma seçeneklerini kolaylaştırır (bilgilerin veteriner klinik uygulamasından insan klinik uygulamasına çevirisi ve bunun tersi de geçerlidir)15. Organoid kültürünün ve bakım yöntemlerinin standardizasyonu ile organoid teknolojisinin daha da ilerlemesi sağlanabilir. Burada sunulan organoid protokol kısmen Saxena ve ark.’nın 201536’dan itibaren daha önce yayınlanmış çalışmalarına dayanmaktadır ve yöntemler köpek bağırsak ve hepatik organoid kültürünün özelliklerine uyacak şekilde uyarlanmıştır. Köpek organoid protokollerinin genel iş akışı Şekil 1’de gösterilmiştir.
Köpek Organoid İzolasyon Protokolü, endoskopik, laparoskopik ve cerrahi biyopsilerin yanı sıra nekropsilerden örnekler elde etme yöntemlerini sunar. Doku örneklerinin ilk ön muamelesini ve laboratuvara nakli için kullanılan metodolojileri özetlemektedir. Organoid izolasyonu için gerekli malzeme ve reaktifler ‘İzolasyona Hazırlık’ bölümünde özetlenmiştir. Doku örneklerinden yetişkin kök hücre izolasyonu süreci ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Son olarak, organoidlerin çözünür bir hücre dışı membran matrisi kullanılarak kubbe benzeri yapılara kaplanması işlemi tartışılmıştır.
İkinci protokol olan Köpek Organoid Bakım Protokolü, organoidleri belgeleme ve kültürleme yöntemlerini açıklar. Medya değişiklikleri ve sıklıkları bu bölümde tartışılmıştır. Ayrıca, 3D köpek organoidlerinin başarılı bir şekilde bakımını sağlamak için gerekli olan hücre kültürlerinin geçiştirilmesi ve temizlenmesi gibi laboratuvar prosedürleri açıklanmaktadır. Uygun pasaj, protokolün kritik bir adımıdır ve bu adımın olası ayarlamaları ve sorun giderme işlemleri makalede daha ayrıntılı olarak tartışılmıştır.
Son protokol, parafin gömme ve RNA koruması için tam yetişkin organoidleri hazırlama yöntemlerini içeren Köpek Organoid Toplama ve Biyobankacılık Protokolüdür. Sıvı azot depolamadaki biyobankacılık organoid numunelerinin yöntemleri de burada açıklanmaktadır. Son olarak, dondurulmuş numuneleri çözmenin ve büyümelerini desteklemenin yolları tartışılmaktadır.
Sonuç olarak, bu makale laboratuvarlar arası protokollerin standardizasyonu yoluyla tutarlı köpek organoid kültürü prosedürleri sağlamayı amaçlamaktadır. Bunu yaparken, makale, köpek organoid modellerinden türetilen verilerin çoğaltılabilirliğini kolaylaştırmayı ve translasyonel biyomedikal araştırmalardaki alaka düzeylerini arttırmayı amaçlamaktadır.
Şekil 1: Köpek organoid protokollerinin iş akışı. Köpek Organoid İzolasyon Protokolü, organoid izolasyon için gerekli malzemelerin hazırlanmasını, bir doku örneğinin toplanmasını (nekropsiler, endoskopik, laparoskopik ve cerrahi biyopsiler yoluyla) ve hücre ayrışması ve hücresel popülasyonun kaplanması konusunda rehberliği açıklar. Köpek Organoid Bakım Protokolü, organoid kültürünün temizlenmesini ve geçirilmesini tartışır. Organoid Hasat ve Biyobankacılık Protokolü, parafin gömme ve daha ileri organoid karakterizasyonu için organoid numunelerin hazırlanmasını tartışmaktadır. Organoid kültürleri biyobankaya yatırma ve sıvı azotta depolamadan canlandırma yöntemleri de tartışılmaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şu anda köpek hepatik ve bağırsak organoidlerinin izolasyonu ve bakımı için standartlaştırılmış protokollerin eksikliği vardır. Bu modelin farklı laboratuvar ortamlarında uygulanabilmesi için organoid kültürler için standart çalışma prosedürlerinin oluşturulması gerekmektedir. Spesifik olarak, bu köpek organoid modellerinin kültürü için standartlaştırılmış çalışma protokolleri sağlamak, organoidlerin kültür sırasında normal büyümesini karakterize etmenin ve genişleme ve bakım için en uygun zaman noktalarını elde etmek için pasajın anahtarıdır. Protokol kullanılarak kültürlenen köpek bağırsak organoidleri daha önce Chandra ve ark.12 ile karakterize edilmiştir.
Protokolün en kritik adımlarından biri organoidlerin geçişidir. Hepatik sferoidlerin ilk geçişi için en uygun zaman, hepatik sferoid ölçümlerine dayanarak izolasyondan sonraki 7. günde olarak belirlenmiştir. Maksimum sferoidlerin hacmine 7. günde ulaşıldı ve aynı zamanda sferoidler tomurcuklanmaya başladı ve hepatik organoidler oluşturdu. İzolasyondan sonraki 2-7. günden itibaren genel organoid hacmindeki artış 365 kattan fazlaydı, bu da optimal geçiş süresinin köpek bağırsak organoid kültüründen daha uzun olduğunu düşündürmektedir. Kültürde 7 gün sonra, hepatik sferoidde brüt hücresel apoptoz bulguları, temizlik veya pasaj olmadan bile gözlenmedi (Şekil 7). Bağırsak ve hepatik organoidlerin paslanması zor olabilir, çünkü prosedür hücre kaybına ve canlılığın değişmesine neden olabilir. Sonuçlar, hepatik organoidlerin tripsin benzeri proteaz (12 dakikaya kadar) ile uzun süreli inkübasyonunun alt kültürü olumsuz yönde etkilemediğini göstermektedir. Organoidlerin tripsin benzeri proteazda 24 dakikadan daha uzun süre inkübe edilmesi, organoidlerin sonraki alt kültürüne zararlı olabilir.
Organoid geçişli hücre kümelerinde suboptimal kırılma durumunda, tripsin benzeri proteaz ile uzun süreli inkübasyon yerine mekanik ayrışma daha faydalı olabilir. Organoidlerin uygun şekilde ayrışması ile ilgili sorunlarla karşılaşılırsa, geçiş verimini arttırmak için numunelerin kısa girdabı denenebilir. Öte yandan, vorteksleme bir kültürü mahvetme ve hücrelere zarar verme potansiyeline sahiptir, bu nedenle yalnızca diğer prosedürler tekrar tekrar başarısız olduğunda kullanılmalıdır. Hepatik organoidleri tek hücrelere ayırmak, organoidlerin büyüme hızını düşürürken, onları hücre kümelerine bölmek canlılıklarını büyük ölçüde artırabilir. Organoid protokol için kuluçka süresi olarak on dakika seçildi. 12 dakikalık bir inkübasyon zaman noktası, tripsin benzeri proteaz deneyinde 24 dakikalık bir inkübasyona kıyasla sitotoksik olarak kabul edilmedi.
Hayatta kalma deneyi, köpek hepatik organoidlerinin olumsuz koşullarda (yapısal ve beslenme tükenmesi) 19.5 güne kadar hayatta kalabileceğini doğruladı. Bu koşullardan en uzun süre kurtulan organoidler CMGF + ortamı ile kültürlendi. Bu gözlem, Kaya inhibitörü ve GSK3β ile desteklenmeyen ortamlarda hepatik organoidlerin daha yavaş büyümesinden kaynaklanmış olabilir. CMGF + R / G ile organoid kültürler daha hızlı büyüdü ve kaynaklarını daha hızlı tüketmiş olabilir. Bu deney, yüksek verimli bir sistem dönüşümü elde etmek için köpek organoid kültürünü minyatürleştirme olanaklarını ortaya çıkarmaktadır. Böyle bir teknoloji, ilaç keşfini veya toksikoloji çalışmalarını önemli ölçüde azaltılmış bir maliyetle kolaylaştırma potansiyelini göstermektedir.
Köpek organoid kültürünün bakımı sırasında karşılaşılan bazı yaygın sorunlar, kaplama sırasında yanlış numune katılaşması, kültür kontaminasyonu ve organoidlerin uygun yoğunluğunu ve boyutunu belirlemektir. Çözünür ECM, kaplama sırasında erken katılaşarsa, derhal 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Çözünür ECM kubbe benzeri yapılar oluşturmuyorsa, numuneden yeterli ortamın çıkarılmamış olması muhtemeldir. Bu durumda, kubbeler oluşana kadar numuneyi daha çözünür bir ECM ile seyreltin.
Bir plakanın tamamında mantar veya bakteriyel kontaminasyon bulunduğunda (bkz. Şekil 4), en iyi çözüm plakayı atmaktır. Antifungal veya antibiyotik ilaçlarla tedavi denenebilir, ancak böyle bir girişimin başarısı son derece düşüktür. Tek bir kuyu bir plakada kirlenmişse, canlı ve etkilenmemiş kuyular yeni bir plakaya temizlenebilir (4.1 ila 4.5 arasındaki adımları izleyin) ve yakından izlenebilir. Numune zaten Acil Durum Dondurulmuşsa, numunenin çözülmesi inkübatörü ek kontaminasyon riskine maruz bıraktığından, numunenin tamamının atılması önerilir.
Sağlıklı organoid kültür en azından orta büyüklükte ve orta yoğunluklu kategoride veya daha büyük olmalıdır. Optimal yoğunluk, organoid kültür büyümesi için çok önemlidir. Düşük yoğunluk, organoidleri orta yoğunluğa kadar temizleyerek düzeltilmelidir. Aşırı yoğunluk durumu ortaya çıkarsa (aşırı kalabalık), organoidler daha fazla kuyuya genişletilmelidir. Hücresel apoptozun brüt belirtileri genellikle organoid kültürün hem aşırı kalabalıklaşmasına hem de düşük yoğunluğuna eşlik eder. Bu sorunlar zamanla düzeltilmezse, tüm organoid kültür birkaç gün içinde apoptotik hale gelecektir. Organoidler ekstra büyük boyuta veya çok yüksek yoğunluğa ulaşırsa, kültür bir deney, donma veya sabitleme için kullanılmalıdır.
Organoid ortam şu anda 17 bileşen içermektedir ve bu nedenle organoid bakım ve genişleme için gereken büyüme faktörlerinin eklenmesi pahalı olabilir. Bu problem, şartlandırılmış CMGF + üretmek için büyüme faktörlerini sentezleyen 2D hücre kültürlerinin büyütülmesiyle çözülebilir. Hücre kültürü L-WRN, Wnt-3a, R-Spondin-3 ve Noggin büyüme faktörlerini37 üretir. Hücre kolonisi% 90 DMEM / F12 ve% 10 FBS kültür medyası kullanır. Kültür yüzde 90 akıcılığa ulaştığında, medya 1 hafta boyunca her gün hasat edilir. Hasat edilen ortam daha sonra 2x CMGF + ile karıştırılır (bu büyüme faktörleri olmadan). 2D kültürler gerekli büyüme faktörlerini maliyetin bir kısmıyla üretebilirken, medyayı üretmek için eklenen zaman ve hazırlık beklenmelidir. Şartlandırılmış ortam partileri arasındaki büyüme faktörlerinin konsantrasyonları da farklılık gösterebilir37,38.
Köpek yetişkin kök hücre kaynaklı organoid kültürleri, Tek Sağlık Girişimi’nin hedeflerine ulaşmaya yardımcı olabilecek benzersiz bir biyomedikal modeldir39. Organoid teknolojisi, gelişim biyolojisi, patofizyoloji, ilaç keşfi ve testi, toksikolojiden bulaşıcı hastalıkların ve rejeneratif tıbbın incelenmesine kadar birçok temel ve biyomedikal araştırma alanında kullanılabilir40. Translasyonel ve ters translasyonel araştırma, köpek organoidlerinin uygulanabilir olduğu alanlardır15. Köpekler yüzyıllardır translasyonel deneysel ortamlarda kullanılmıştır ve eşlik eden hayvan statüleri de veteriner hekimlikte en çok araştırılan türlerden biri olarak konumlarını kolaylaştırmıştır.
Sonuç olarak, bu makale bu modelin çeşitli biyomedikal alanlarda uygulanmasını kolaylaştırmak için köpek hepatik ve intestinal organoidlerinin izolasyonu, bakımı, toplanması ve biyobankacılığı için standartlaştırılmış çalışma protokolleri sunmaktadır. Bu model, bilginin disiplinler arası ve disiplinler arası paylaşımını teşvik etmek için Tek Sağlık Girişimi’nin bir aracı olarak ters çeviri araştırmasını teşvik etmek için benzersiz bir şekilde uygundur.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, Iowa Eyalet Üniversitesi çalışanlarının Veteriner Teşhis Laboratuvarı’na, yani Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victoria J. Green ve Jennifer M. Groeltz-Pamukçuk’a, sağlanan örneklerin zamanında işlenmesi için şükranlarını ifade etmek istiyorlar. Yazarlar, Fakülte Başlangıcı, ISU VPR Miller Ödülü, ISU VPR Miller Ödülü ve ISU # 1912948’ye NSF SBIR alt ödülünün desteğini kabul etmek istiyor.
Chelating solution | |||
D-Sorbitol | Fisher Chemical | BP439-500 | |
DTT | Promega | V3151 | |
KCl | Fisher Chemical | P217-500 | |
KH2PO4 | Sigma | P5655-100G | |
Na2HPO4-2H2O | Sigma | S5136-100G | |
NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Sucrose | Fisher Chemical | S5-500 | |
Organoid media | |||
[Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
FBS | Corning | 35-010-CV | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
Trimethoprim | Sigma | T7883-5G | |
Sulfamethoxazole | Sigma-Aldrich | S7507-10G | |
Reagents | |||
Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Chemicals | D128-500 | |
EDTA, pH 8.0, 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
RNAlater Soln. | Invitrogen | AM7021 | RNA Storage Reagent |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
Altro | |||
6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
ACD Hybez II Hybridization System | ACD a biotechne brand | 321710 | |
Centrifuge Tube, 15 mL | Corning | 430766 | |
CoolCell LX | Corning | BCS-405MC | |
Cryogenic Vials | Corning | 430488 | |
Disposable Centrifuge Tube (50 mL) | Fisherbrand | 05-539-13 | |
GyroMini Nutating mixer (Rocker) | Labnet | S0500-230V-EU | |
Heat Bath | Lab-Line Instruments | 3000 | |
Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | SpectrophotometerAnalysis |
Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Laboratory Flexible Film Tape |
Protected Disposable Scalpels | Bard-Parker | 239844 | |
RNAscope 2.5 HD Assay – RED | ACD a biotechne brand | 322350 | |
RNAscope H2O2 & Protease Plus Reagents | ACD a biotechne brand | 322330 | |
RNAscope Target Retrieval Reagents | ACD a biotechne brand | 322000 | |
RNAscope Wash Buffer Reagents | ACD a biotechne brand | 310091 | |
Tissue Culture Dish | Dot Scientific | 6676621 | |
Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |