يتم وصف الطرق التجريبية لحصاد الخلايا الجذعية البالغة من الأنسجة المعوية والكبدية للكلاب لإنشاء ثقافات عضوية 3D. علاوة على ذلك ، تتم مناقشة التقنيات المختبرية لضمان النمو المتسق وتوفير إجراءات تشغيل قياسية للحصاد والبنك الحيوي وإحياء مزارع الكلاب المعوية والكبدية.
تصاب الكلاب بأمراض معقدة متعددة العوامل مماثلة للبشر ، بما في ذلك الأمراض الالتهابية وأمراض التمثيل الغذائي والسرطان. لذلك ، فإنها تمثل نماذج حيوانية كبيرة ذات صلة مع إمكانات انتقالية للطب البشري. المواد العضوية هي 3 أبعاد (3D) ، وهي هياكل ذاتية التجميع مشتقة من الخلايا الجذعية التي تحاكي التشريح الدقيق وعلم وظائف الأعضاء لجهازها الأصلي. يمكن استخدام هذه النماذج الانتقالية في المختبر لنفاذية الأدوية وتطبيقات الاكتشاف ، وتقييم السموم ، وتوفير فهم ميكانيكي للفيزيولوجيا المرضية للأمراض المزمنة متعددة العوامل. علاوة على ذلك ، يمكن للكلاب العضوية تحسين حياة الكلاب المرافقة ، وتوفير مدخلات في مختلف مجالات البحوث البيطرية وتسهيل تطبيقات العلاج الشخصية في الطب البيطري. يمكن لمجموعة صغيرة من المتبرعين إنشاء بنك حيوي من العينات العضوية ، مما يقلل من الحاجة إلى حصاد الأنسجة المستمر ، حيث يمكن زراعة خطوط الخلايا العضوية إلى أجل غير مسمى. هنا ، يتم تقديم ثلاثة بروتوكولات تركز على ثقافة عضويات الكلاب المعوية والكبدية المشتقة من الخلايا الجذعية البالغة. يحدد بروتوكول عزل الكلاب العضوي طرقا لمعالجة الأنسجة وتضمين عزل الخلية في مصفوفة داعمة (مصفوفة غشاء خارج الخلية قابلة للذوبان). يصف بروتوكول صيانة الكلاب العضوية نمو العضوية وصيانتها ، بما في ذلك التنظيف والمرور جنبا إلى جنب مع التوقيت المناسب للتوسع. يصف بروتوكول الحصاد العضوي والبنوك الحيوية طرقا لاستخراج المواد العضوية وتجميدها والحفاظ عليها لمزيد من التحليل.
القوارض هي النموذج الحيواني الأكثر استخداما للبحوث الطبية الحيوية والانتقالية1. وهي مفيدة بشكل استثنائي للتحقيق في التسبب الجزيئي الأساسي للأمراض، على الرغم من أن أهميتها السريرية للأمراض المزمنة متعددة العوامل قد تم التشكيك فيها مؤخرا2. يظهر نموذج الكلاب العديد من المزايا مقارنة بالقوارض3,4. تشترك الكلاب والبشر في أوجه التشابه في الأيض والميكروبيوم المعوي الذي تطور بسبب استهلاك النظام الغذائي البشري طوال فترات مختلفة من تدجينها5،6،7. أوجه التشابه بين الكلاب وتشريح الجهاز الهضمي البشري وعلم وظائف الأعضاء هي مثال آخر من الأمثلة 8.
بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تشارك الكلاب بيئات وأنماط حياة مماثلة مع أصحابها9. يسمح العمر الأطول للكلاب مقارنة بالقوارض بالتطور الطبيعي للعديد من الحالات المزمنة10. مرض التهاب الأمعاء أو متلازمة التمثيل الغذائي هي أمثلة على الأمراض المزمنة متعددة العوامل التي تشترك في أوجه تشابه مهمة بين البشر والكلاب11،12. يمكن للتجارب قبل السريرية للكلاب التي تشمل الكلاب المصابة بأمراض تحدث بشكل طبيعي أن تولد بيانات أكثر موثوقية من تلك المكتسبة من نماذج القوارض13. ومع ذلك ، لتقليل استخدام أبحاث الحيوانات الحية والامتثال لمبادئ 3Rs (تقليل ، صقل ، استبدال) 14 ، ظهرت بدائل للاختبار في الجسم الحي باستخدام عضويات الكلاب ثلاثية الأبعاد في المختبر 15.
Organoids هي هياكل مشتقة من الخلايا الجذعية ثلاثية الأبعاد ذاتية التجميع تلخص علم وظائف الأعضاء والتشريح الدقيق لأعضائها الأصلية16,17. تم وصف هذه التقنية لأول مرة من قبل ساتو وآخرون في عام 200917 وسمحت بإجراء دراسات أكثر قابلية للترجمة في المختبر في خطوط الخلايا الظهارية مما كان ممكنا في السابق باستخدام مزارع الخلايا السرطانية ثنائية الأبعاد18،19،20. المواد العضوية مفيدة في النماذج المختبرية في العديد من التخصصات الطبية الحيوية مثل السمية قبل السريرية 21،22،23 ، أو الامتصاص ، أو دراسات التمثيل الغذائي24،25،26،27،28 ، وكذلك في النهج الطبية الشخصية29،30،31 . تم وصف الثقافة الناجحة للعضويات المعوية للكلاب لأول مرة في عام 201912 ، في حين تم الإبلاغ عن المواد العضوية الكبدية المشتقة من لأول مرة من قبل Nantasanti et al. في عام 201532. ومنذ ذلك الحين تم استخدام عضويات الكلاب بنجاح في الدراسات التي تبحث في الاعتلالات المعوية المزمنة للكلاب ، وأورام اللحمية المعدية المعوية ، وسرطان القولون والمستقيم الغدي 12 ، ومرض ويلسون33،34.
في حين يمكن حصاد الخلايا الجذعية البالغة عن طريق الاستئصال ، فإن التكنولوجيا العضوية لا تتطلب دائما التضحية بالحيوانات. الخزعات بالمنظار والمنظار، أو حتى شفط الأعضاء بالإبرة الدقيقة35، هي مصدر قابل للتطبيق للخلايا الجذعية البالغة للعزل العضوي الظهاري12. ويسهل الاستخدام الواسع النطاق لهذه التقنيات غير الغازية في الممارسة البيطرية خيارات البحوث الانتقالية العكسية (ترجمة المعلومات من الممارسة السريرية البيطرية إلى الممارسة السريرية البشرية والعكس صحيح)15. يمكن ضمان المزيد من التقدم في التكنولوجيا العضوية من خلال توحيد ثقافة العضوية وطرق الصيانة. يعتمد البروتوكول العضوي المعروض هنا جزئيا على العمل المنشور سابقا ل Saxena et al. من عام 201536 ، وتم تكييف الطرق لتناسب تفاصيل ثقافة الكلاب المعوية والكبدية. ويبين الشكل 1 سير العمل العام لبروتوكولات الكلاب العضوية.
يقدم بروتوكول عزل الكلاب العضوي طرقا للحصول على عينات من الخزعات بالمنظار والمنظار والجراحة ، بالإضافة إلى النخر. وهو يحدد المعالجة الأولية المسبقة لعينات الأنسجة والمنهجيات المستخدمة للنقل إلى المختبر. يتم تلخيص المواد والكواشف اللازمة للعزل العضوي في قسم “التحضير للعزلة”. يتم وصف عملية عزل الخلايا الجذعية البالغة من عينات الأنسجة بمزيد من التفصيل. أخيرا ، تتم مناقشة عملية طلاء المواد العضوية في هياكل تشبه القبة باستخدام مصفوفة غشاء خارج الخلية قابلة للذوبان.
البروتوكول الثاني ، بروتوكول صيانة الكلاب العضوية ، يصف طرق توثيق وزراعة المواد العضوية. تتم مناقشة تغييرات الوسائط وتواترها في هذا القسم. علاوة على ذلك ، يتم وصف الإجراءات المختبرية مثل تمرير وتنظيف مزارع الخلايا ، والتي تعد ضرورية لضمان الصيانة الناجحة للعضويات الكلاب 3D. يعد التمرير المناسب خطوة حاسمة في البروتوكول ، ويتم مناقشة التعديلات المحتملة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لهذه الخطوة بشكل أكبر في المخطوطة.
البروتوكول الأخير هو حصاد الكلاب العضوي وبروتوكول البنوك الحيوية الذي يحتوي على طرق لإعداد المواد العضوية الكاملة النمو لتضمين البارافين والحفاظ على الحمض النووي الريبي. كما يتم وصف طرق عينات العضوية من البنوك الحيوية في تخزين النيتروجين السائل هنا. وأخيرا، تتم مناقشة طرق إذابة العينات المجمدة ودعم نموها.
في الختام ، تهدف هذه المقالة إلى توفير إجراءات متسقة للاستزراع العضوي للكلاب من خلال توحيد البروتوكولات بين المختبرات. ومن خلال القيام بذلك، تهدف المخطوطة إلى تسهيل تكرار البيانات المستمدة من النماذج العضوية للكلاب لزيادة أهميتها في البحوث الطبية الحيوية الانتقالية.
الشكل 1: سير عمل بروتوكولات الكلاب العضوية. يصف بروتوكول عزل الكلاب العضوي إعداد المواد اللازمة للعزل العضوي ، وحصاد عينة من الأنسجة (من خلال وسائل النخر ، والمنظار ، والمنظار ، والخزعات الجراحية) ، والتوجيه بشأن تفكك الخلايا وطلاء السكان الخلويين. يناقش بروتوكول صيانة الكلاب العضوية تنظيف وتمرير ثقافة العضوي. يناقش بروتوكول الحصاد العضوي والبنوك الحيوية إعداد عينات عضوية لتضمين البارافين والمزيد من التوصيف العضوي. كما تناقش طرق المزارع العضوية للبنوك الحيوية وإحيائها من التخزين في النيتروجين السائل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يوجد حاليا نقص في البروتوكولات الموحدة المتاحة لعزل وصيانة الكلاب العضوية الكبدية والمعوية. إن وضع إجراءات تشغيل موحدة للمزارع العضوية له ما يبرره لكي يكون هذا النموذج قابلا للتطبيق في بيئات مختبرية مختلفة. على وجه التحديد ، يعد توفير بروتوكولات تشغيل موحدة لزراعة نماذج الكلاب العضوية هذه أمرا أساسيا لتوصيف النمو الطبيعي للعضويات أثناء الزراعة والمرور لاشتقاق نقاط زمنية مثالية للتوسع والصيانة. وقد سبق أن تميزت الكلاب العضوية المعوية المستزرعة باستخدام البروتوكول من قبل تشاندرا وآخرون 12.
واحدة من أهم خطوات البروتوكول هي تمرير المواد العضوية. تم تحديد الوقت الأمثل للمرور الأول من الكرويات الكبدية ليكون في اليوم 7 بعد العزل بناء على قياسات كروية كبدية. تم تحقيق الحد الأقصى لحجم الكرويات بحلول اليوم 7 ، وفي الوقت نفسه ، بدأت الكرويات في البرعم وشكلت عضويات كبدية. كانت الزيادة في الحجم الكلي للعضويات من اليوم 2-7 بعد العزل أكثر من 365 مرة ، مما يشير إلى أن وقت المرور الأمثل أطول من ثقافة الكلاب العضوية المعوية. بعد 7 أيام في الثقافة ، لم تلاحظ أي علامات إجمالية على موت الخلايا المبرمج الخلوي في الكروية الكبدية ، حتى بدون تنظيف أو مرور (الشكل 7). يمكن أن يكون تمرير المواد العضوية المعوية والكبدية أمرا صعبا لأن الإجراء يمكن أن يؤدي إلى فقدان الخلايا وتغيير قابلية البقاء. تشير النتائج إلى أن الحضانة المطولة للعضويات الكبدية مع البروتياز الشبيه بالتريبسين (حتى 12 دقيقة) لا تؤثر سلبا على الثقافة الفرعية. احتضان المواد العضوية في البروتياز الشبيه بالتريبسين لفترة أطول من 24 دقيقة يمكن أن يكون ضارا بالثقافة الفرعية اللاحقة للعضويات.
في حالة الكسر دون المستوى الأمثل في مجموعات الخلايا مع الممر العضوي ، قد يكون التفكك الميكانيكي بدلا من الحضانة المطولة مع البروتياز الشبيه بالتريبسين أكثر فائدة. إذا واجهت مشاكل في الانفصال السليم للعضويات ، فقد تتم محاولة دوامة قصيرة للعينات لتعزيز عائد المرور. من ناحية أخرى ، فإن الدوامة لديها القدرة على تدمير الثقافة وإتلاف الخلايا ، لذلك يجب استخدامها فقط عندما تفشل الإجراءات الأخرى بشكل متكرر. إن كسر المواد العضوية الكبدية إلى خلايا مفردة يقلل من معدل نمو المواد العضوية ، في حين أن تقسيمها إلى مجموعات من الخلايا يمكن أن يحسن بشكل كبير من قدرتها على البقاء. تم اختيار عشر دقائق كوقت حضانة للبروتوكول العضوي. واعتبرت نقطة الحضانة التي تبلغ مدتها 12 دقيقة غير سامة للخلايا مقارنة بحضانة مدتها 24 دقيقة في تجربة البروتياز الشبيهة بالتريبسين.
أكدت تجربة البقاء على قيد الحياة أن الخلايا العضوية الكبدية للكلاب يمكن أن تعيش لمدة تصل إلى 19.5 يوما في ظروف غير مواتية (استنزاف هيكلي وتغذوي). تم استزراع المواد العضوية التي نجت من هذه الظروف لفترة أطول باستخدام وسائط CMGF +. قد تكون هذه الملاحظة ناتجة عن النمو البطيء للعضويات الكبدية في الوسائط غير المكملة بمثبطات الصخور و GSK3β. نمت الثقافات العضوية مع CMGF + R / G بشكل أسرع وربما استنفدت مواردها بشكل أسرع. تفتح هذه التجربة إمكانيات تصغير ثقافة الكلاب العضوية لتحقيق تحويل نظام عالي الإنتاجية. وتظهر هذه التكنولوجيا إمكانية تسهيل اكتشاف الأدوية أو دراسات علم السموم بتكلفة مخفضة إلى حد كبير.
بعض المشاكل الشائعة التي تواجهها أثناء صيانة تربية الكلاب العضوية هي تصلب العينات غير السليم عند الطلاء ، وتلوث الثقافة ، وتحديد الكثافة والحجم المناسبين للعضويات. إذا تصلب ECM القابل للذوبان قبل الأوان أثناء الطلاء ، فضعه على الفور على الجليد لمدة 10 دقائق. إذا لم يشكل ECM القابل للذوبان هياكل تشبه القبة ، فمن المحتمل أنه لم تتم إزالة وسائط كافية من العينة. إذا كان هذا هو الحال ، فقم بتخفيف العينة باستخدام ECM أكثر قابلية للذوبان حتى تتشكل القباب.
عندما يتم العثور على تلوث فطري أو بكتيري في لوحة كاملة (انظر الشكل 4) ، فإن أفضل حل هو التخلص من اللوحة. يمكن محاولة العلاج بالأدوية المضادة للفطريات أو المضادات الحيوية ، ولكن نجاح هذه المحاولة منخفض للغاية. إذا كانت بئر واحدة ملوثة في صفيحة، يمكن تنظيف الآبار القابلة للحياة وغير المتأثرة (اتبع الخطوات من 4.1 إلى 4.5) إلى صفيحة جديدة ومراقبتها عن كثب. إذا كانت العينة قد تم تجميدها بالفعل في حالات الطوارئ ، فمن المستحسن التخلص من العينة بأكملها ، لأن ذوبان العينة يعرض الحاضنة لخطر تلوث إضافي.
يجب أن تكون الثقافة العضوية الصحية على الأقل في فئة متوسطة الحجم ومتوسطة الكثافة أو أكبر. الكثافة المثلى أمر بالغ الأهمية لنمو الثقافة العضوية. يجب تصحيح الكثافة المنخفضة عن طريق تنظيف المواد العضوية إلى متوسطة الكثافة. إذا حدثت حالة الكثافة القصوى (الاكتظاظ) ، فيجب توسيع المواد العضوية إلى المزيد من الآبار. غالبا ما تصاحب العلامات الإجمالية لموت الخلايا المبرمج كلا من الاكتظاظ والكثافة المنخفضة للثقافة العضوية. إذا لم يتم تصحيح هذه المشكلات في الوقت المناسب ، فستتحول الثقافة العضوية بأكملها إلى استماتة في غضون أيام. إذا حققت المواد العضوية حجما كبيرا جدا أو كثافة عالية جدا ، فيجب استخدام الثقافة لإجراء تجربة أو تجميد أو تثبيت.
تحتوي الوسائط العضوية حاليا على 17 مكونا ، وبالتالي فإن إضافة عوامل النمو اللازمة لصيانة العضوية وتوسيعها يمكن أن تكون مكلفة. يمكن حل هذه المشكلة عن طريق زراعة مزارع الخلايا 2D التي تجمع عوامل النمو لإنتاج CMGF + مشروطة. تنتج زراعة الخلايا L-WRN عوامل نمو Wnt-3a و R-Spondin-3 و Noggin 37. تستخدم مستعمرة الخلية 90٪ DMEM / F12 و 10٪ وسائط ثقافة FBS. عندما تحقق الثقافة 90 في المئة من الالتقاء ، يتم حصاد وسائل الإعلام كل يوم لمدة 1 أسبوع. ثم يتم خلط الوسائط التي يتم حصادها مع 2x CMGF + (بدون عوامل النمو هذه). في حين أن الثقافات 2D يمكن أن تنتج عوامل النمو اللازمة في جزء صغير من التكلفة، يجب توقع الوقت الإضافي والاستعداد لإنتاج وسائل الإعلام. يمكن أن تختلف تركيزات عوامل النمو بين دفعات الوسائط المشروطة أيضا37,38.
تعد مزارع الكلاب العضوية المشتقة من الخلايا الجذعية للبالغين نموذجا طبيا حيويا فريدا يمكن أن يساعد في تحقيق أهداف مبادرة الصحة الواحدة39. يمكن استخدام التكنولوجيا العضوية في العديد من مجالات البحوث الأساسية والطبية الحيوية ، والتي تمتد من البيولوجيا التنموية ، والفيزيولوجيا المرضية ، واكتشاف الأدوية واختبارها ، وعلم السموم إلى دراسة الأمراض المعدية والطب التجديدي 40. البحوث الانتقالية والعكسية هي المجالات التي تنطبق فيها عضويات الكلاب 15. تم استخدام الكلاب لعدة قرون في إعدادات تجريبية متعدية ، كما أن وضعها الحيواني المصاحب لها قد سهل مكانتها كواحدة من أكثر الأنواع استكشافا في الطب البيطري.
في الختام ، توفر هذه المخطوطة بروتوكولات تشغيل موحدة لعزل وصيانة وحصاد وبنوك حيوية للكلاب العضوية الكبدية والمعوية لتسهيل تطبيق هذا النموذج في مختلف المجالات الطبية الحيوية. هذا النموذج مناسب بشكل فريد لتعزيز البحوث الانتقالية العكسية كأداة لمبادرة الصحة الواحدة لتعزيز تبادل المعرفة بين التخصصات وداخلها.
The authors have nothing to disclose.
يريد المؤلفون التعبير عن امتنانهم لموظفي مختبر التشخيص البيطري التابع لجامعة ولاية أيوا ، وهم هالي م. لامبرت ، وإميلي راهي ، وروزالين م. برانامان ، وفيكتوريا ج. غرين ، وجنيفر م. غرولتز ثراش ، على معالجة العينات المقدمة في الوقت المناسب. يرغب المؤلفون في الاعتراف بالدعم المقدم من بدء تشغيل أعضاء هيئة التدريس ، وجائزة ISU VPR Miller ، وجائزة ISU VPR Miller ، والجائزة الفرعية NSF SBIR إلى ISU # 1912948.
Chelating solution | |||
D-Sorbitol | Fisher Chemical | BP439-500 | |
DTT | Promega | V3151 | |
KCl | Fisher Chemical | P217-500 | |
KH2PO4 | Sigma | P5655-100G | |
Na2HPO4-2H2O | Sigma | S5136-100G | |
NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Sucrose | Fisher Chemical | S5-500 | |
Organoid media | |||
[Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
FBS | Corning | 35-010-CV | |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
Trimethoprim | Sigma | T7883-5G | |
Sulfamethoxazole | Sigma-Aldrich | S7507-10G | |
Reagents | |||
Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Chemicals | D128-500 | |
EDTA, pH 8.0, 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
RNAlater Soln. | Invitrogen | AM7021 | RNA Storage Reagent |
TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
Altro | |||
6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
ACD Hybez II Hybridization System | ACD a biotechne brand | 321710 | |
Centrifuge Tube, 15 mL | Corning | 430766 | |
CoolCell LX | Corning | BCS-405MC | |
Cryogenic Vials | Corning | 430488 | |
Disposable Centrifuge Tube (50 mL) | Fisherbrand | 05-539-13 | |
GyroMini Nutating mixer (Rocker) | Labnet | S0500-230V-EU | |
Heat Bath | Lab-Line Instruments | 3000 | |
Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | SpectrophotometerAnalysis |
Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Laboratory Flexible Film Tape |
Protected Disposable Scalpels | Bard-Parker | 239844 | |
RNAscope 2.5 HD Assay – RED | ACD a biotechne brand | 322350 | |
RNAscope H2O2 & Protease Plus Reagents | ACD a biotechne brand | 322330 | |
RNAscope Target Retrieval Reagents | ACD a biotechne brand | 322000 | |
RNAscope Wash Buffer Reagents | ACD a biotechne brand | 310091 | |
Tissue Culture Dish | Dot Scientific | 6676621 | |
Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |