我们描述了一种在市售微流体装置中产生人类运动单元的方法,方法是将人诱导多能干细胞衍生的运动神经元与人类原代介观细胞衍生的肌管共同培养,从而形成功能活性的神经肌肉接头。
神经肌肉接头(NMJ)是下运动神经元的轴突和肌肉之间的特殊突触,促进肌肉收缩的参与。在运动神经元疾病中,如肌萎缩性侧索硬化症(ALS)和脊髓性肌萎缩症(SMA),NMJs退化,导致肌肉萎缩和进行性麻痹。NMJ退化的潜在机制尚不清楚,主要是由于缺乏可翻译的研究模型。这项研究旨在创建具有功能性NMJ的人类运动单元的多功能且可重复的 体外 模型。因此,在市售的微流体装置中共培养了人诱导多能干细胞(hiPSC)衍生的运动神经元和人原发性介观母细胞(MAB)衍生的肌管。使用流体隔离的微隔室可以维持细胞特异性微环境,同时允许通过微凹槽进行细胞间接触。通过应用趋化和体积梯度,刺激运动神经元 – 神经突起通过促进肌管相互作用的微凹槽的生长和NMJ的形成。这些NMJ通过运动神经元突触前标志物突触素(SYP)和突触后乙酰胆碱受体(AChR)标志物α-bungarotox(Btx)在肌管上的共定位进行免疫细胞化学鉴定,并使用扫描电子显微镜(SEM)进行形态学表征。NMJ的功能通过测量运动神经元去极化时肌管中的钙反应来证实。使用标准微流体装置和干细胞技术生成的运动单元可以帮助未来专注于健康和疾病中NMJ的研究。
NMJ通过释放神经递质促进下脊柱运动神经元和骨骼肌纤维之间的通信1。在ALS和SMA等运动神经元疾病中,NMJs退化,导致与肌肉的通信中断2,3,4,5,6,7。这导致患者逐渐失去肌肉功能,这导致他们被轮椅束缚,并最终依赖于呼吸系统生命支持,因为重要肌肉群如隔膜等逐渐萎缩。导致这些疾病中NMJs严重丧失的确切潜在机制尚不清楚。已经对转基因动物模型进行了许多研究,这使我们对NMJ变性的发病机制有了一定的了解5,6,8,9,10,11。然而,为了充分了解病理学并抵消去神经支配,重要的是要有一个允许完全可及性的人类系统。
在这里,该协议描述了一种相对简单的方法,通过使用市售的微流体装置共培养hiPSC衍生的运动神经元和人类原代MAB衍生的肌管来产生人类NMJ。自20世纪70年代末首次描述”Campenot”室12 以来,使用微流体来极化和流体分离神经元的体细胞和轴突就已经为人所知。从那时起,已经制造了更多的微流体设计,包括商业选择。该协议中使用的设备包含两个隔间,每个隔间由两个与通道13连接的孔组成。两个隔间是镜像的,并用几个微槽连接。这些微凹槽的尺寸有助于神经突生长,同时通过毛细管静水压力保持两个隔室之间的流体隔离13,14。使用该系统,可以在一个隔室中培养运动神经元,在另一个隔室中培养肌肉细胞,每个隔室在其特定的培养基中培养,同时仍然通过穿过微凹槽的神经突起并促进物理连接并与肌肉细胞结合。该模型为人类运动单元提供了一个完全可访问和适应性强的 体外 系统,可用于研究ALS和SMA等疾病的早期NMJ病理学。
该协议描述了一种相对易于使用的方法,该方法在不到30天的时间内在市售的微流体装置中生成具有功能NMJ的人体运动单元。它描述了如何通过ICC和SEM等标准技术在形态学上评估NMJ,并通过活细胞钙记录进行功能评估。
该协议的一大优点是使用干细胞技术。这允许完全的适应性,其中NMJ可以在健康和疾病中进行评估,而与供体概况无关。该模型已被证明在ALS研究中已经成功且有益,其中我们发现由于 FUS 基因突变而导致的神经突出生长,再生和NMJ数量的损伤是新的表型18。通过该模型,通过使用来自散发性ALS患者的iPSCs,可以将研究扩展到包括散发形式的ALS,其中病因尚不清楚。与传统动物模型相比,这提供了优势,传统动物模型依靠突变基因的转基因过表达来概括人类疾病23,24。此外,我们完全由人类组成的系统可以潜在地概括人类特定的生理学和疾病。先前的研究表明啮齿动物和人类NMJ形态之间的差异25,这表明在使用啮齿动物解决人类NMJ病理学时必须谨慎行事。虽然该系统是一个相对简单的 体外 设置,缺乏 体内 模型的复杂性,但有可能证明微流体装置中显示的NMJ形态类似于人类截肢者的NMJs25。此外,该模型允许在NMJ形成和成熟期间进行NMJ评估,可能揭示早期疾病表型,这些表型在人类死后样本中不存在,无法识别或被忽视。
MABs提供了产生肌管的有效选择,尽管它们有限的10天存活是该系统的缺点。肌管存活依赖于它们对表面的附着,这可能受到肌纤维自发收缩的影响。超过10天后,大多数肌管将分离,使NMJ培养物无法使用。理想情况下,肌管也将从iPSCs产生。然而,由于融合指数27,28,29,30的可变性,目前的方案已被证明难以重现26。
通过使用市售的微流体装置,我们生成了一个完全可访问的标准化系统。其他NMJ模型存在31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42。然而,它们通常依赖于单个隔室,缺乏细胞类型之间的区室化和流体分离,或者依赖于定制的培养容器,这降低了可用性,并可能降低可重复性。用于该协议的微流体装置可以购买各种长度的微槽,这允许进一步分析,例如轴突转运43,44 或轴突切开术18,45,46 研究。隔室之间的流体隔离进一步实现了运动神经元或肌管的区室化药物治疗,这可能有利于治疗的发展。更多专门从事微流体的公司已经出现,这为大量的设备设计和功能提供了选择,进一步促进了 体外 研究的可及性。
总之,我们开发了一种方案,提供了一种可靠,多功能和简单的方法来培养具有功能性NMJ的人体运动单元。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢来自LiMoNe的Nikky Corthout和Sebastian Munck,研究小组分子神经生物学(VIB-KU Leuven)对活细胞钙瞬时荧光记录的建议。这项研究得到了比利时和卢森堡富布赖特委员会,KU Leuven(C1和”开放未来”基金),VIB,科学技术创新机构(IWT;SBO-iPSCAF)、”法兰德斯科学研究基金”(FWO-Vlaanderen)、目标ALS、ALS Liga België(ALS的治愈方法)、比利时政府(由比利时联邦科学政策办公室发起的大学间吸引力极点计划P7/16)、Thierry Latran基金会和”比利时抵抗疾病神经肌肉组织协会”(ABMM)。T.V.和J.B由FWO-Vlaanderen颁发的博士奖学金支持。
α-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | B35451 | Antibody (1:1000) |
Acetic Acid | CHEM-Lab NV | CL00.0116.1000 | Coating component. H226, H314. P280 |
Aclar 33C sheet (SEM sheet) | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | Thickness: 7.8 mil |
Agrin (recombinant human protein) | R&D systems | 6624-AG-050 | Media supplement |
Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Antibody (1:1000) |
Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Antibody (1:1000) |
Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Antibody (1:1000) |
Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Antibody (1:1000) |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | Media component |
βIII-tubulin (Tubulin) | Abcam | ab7751 | Antibody (1:500) |
β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | Media component. H317. P280. |
B-27 without vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | Media component |
BDNF (brain-derived neurotrophic factor) | Peprotech | 450-02B | Growth factor |
bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor) | Peprotech | 100-18B | Growth factor |
Choline acetyltransferase (ChAT) | Millipore | ab144P | Antibody (1:500) |
Collagen from calfskin | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | Coating component |
CNTF (ciliary neurotrophic factor) | Peprotech | 450-13B | Growth factor |
DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | Immunocytochemistry component |
DAPT | Tocris Bioscience | 2634 | Media supplement |
Desmin | Abcam | Ab15200 | Antibody (1:200) |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Media component |
DMSO | Sigma | D2650-100ML | Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280. |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | no calcium, no magnesium |
Ethanol | VWR | 20.821.296 | Sterilization. H225. P280 |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | Media component |
Fluo-4 AM live cell dye | Thermo Fisher Scientific | F14201 | Calcium imaging dye |
Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | Immunocytochemistry component |
GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) | Peprotech | 450-10B | Growth factor |
Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1020 | Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280. |
Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | Media component |
Human alkaline phosphatase | R&D systems | MAB1448 | Antibody |
ImageJ software | NIH | ICC analysis | |
IMDM | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | Media component |
Insulin transferrin selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | Media component |
Islet-1 | Millipore | ab4326 | Antibody (1:400) |
Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Cryopreservation component |
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020-1MG | Coating component and media supplement |
Leica SP8 DMI8 confocal microscope | Leica | ICC confocal microscopy | |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Media component |
Myogenin (MyoG) | Abcam | Ab124800 | Antibody (1:500) |
Myosin heavy chain (MyHC) | In-house, SCIL | Antibody (1:20) | |
N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | Media component |
Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Coating and media component |
Neurofilament heavy chain (NEFH) | Abcam | AB8135 | Antibody (1:1000) |
Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Live-cell calcium imaging microscopy | |
NIS-Elements AR 4.30.02 software | Nikon | Live-cell calcium imaging analysis | |
Non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Media component |
Normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | Immunocytochemistry component |
Olig2 | IBL | 18953 | Antibody (1:1000) |
Parafilm M | Sigma | P7793-1EA | Storing equipment |
Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280. |
Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Media component |
Petri dish (3 cm) | nunc | 153066 | Diameter: 3 cm |
Petri dish (10 cm) | Sarstedt | 833.902 | Diameter: 10 cm |
Plate (6-well) | Cellstar Greiner bio-one | 657160 | Culture plate |
Pluronic F-127 | Thermo Fisher Scientific | P3000MP | Fluo-4 dye solvent |
Poly-L-ornithine (PLO) | Sigma | P3655-100MG | Coating component |
Potassium chloride | CHEM-Lab NV | CL00.1133.1000 | Calcium imaging reagent |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280. |
RevitaCell supplement | Thermo Fisher Scientific | A2644501 | ROCK inhibitor solution |
Smoothened agonist | Merch Millipore | 566660 | Media supplement |
Sodium cacodylate buffer | Sigma | C0250 | Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280. |
Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | Media component |
Synaptophysin (SYP) | Cell Signaling | 5461S | Antibody (1:1000) |
T75 flask | Sigma | CLS3276 | Culture plate |
Titin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 9D10 | Antibody (1:300) |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280 |
TrypLE express | Thermo Fisher Scientific | 12605010 | MAB dissociation solution |
Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379-100G | Acetylcholine receptor blocker. H301. P280. |
XonaChips pre-assembled microfluidic device | Xona Microfluidics | XC150 | Microgroove length: 150 μm |
Xona Silicone microfluidics device | Xona Microfluidics | SND75 | Microgroove length: 75 μm |