미세 유체 장치에서 기능성 신경 근육 접합을 갖춘 인간 모터 유닛 생성

iPSC 생성 및 MAB 수확을 위해 샘플을 제공한 모든 피험자로부터 서면 통보 동의를 얻었습니다. 절차는 대학 병원 루벤 (n ° S5732-ML11268)의 의료 윤리위원회와 StemBANCC 프로젝트의 일환으로 영국의 주요 연구 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 시약 및 장비는 재료 표 에 나열되어 있으며 멸균을 사용해야 합니다. 미디어가 달리 지정되지 않는 한 사용하기 전에 RT(실온)로 가열해야 합니다. 공동 문화 프로토콜에 대한 개요는 그림 1을 참조하십시오. 1. iPSCs에서 운동 신경 선조의 차별화 이전 연구에서 적응된 운동 뉴런 분화 프로토콜15를 따라 10일 신경 전구(NPC) 상태에 도달할 때까지. 프로토콜의 기간에 따르면, 차별화는 월요일 (0 일)에 시작되며, 목요일에 10 NPC가 발생합니다. 냉동 보존 일 10 NPC는 유리병 당 2 x 106- 4 x 106 세포의 밀도에서 10 % 디메틸 설산화물 (DMSO)와 녹아웃 혈청 교체.주의: DMSO는 독성이 있습니다: 개인 보호 장비가 있는 연기 후드에서 처리하십시오.참고: 10개의 NPC는 해동 시 매우 중요할 것으로 예상되는 날의 약 50%가 될 것으로 예상됩니다. 이 ‘일 10 NPC’ 상태에서 모터 뉴런 분화 프로토콜을 중지하고 NPC를 냉동보존하여 많은 수의 NPC를 생성하여 나중에 뱅크및 사용할 수 있으며, 공동 배양 프로토콜의 전체 타임라인의 길이를 총 28일에서 19일로 줄입니다. 2. 인간 MAB의 파생 및 유지 보수 참고: MABs는 58 세의 건강한 기증자로부터 얻은 생검에서 수확 된 용기 관련 중간 엽 줄기 세포입니다. 대체 상용 소스를 사용할 수 있습니다. MAB를 얻기 위한 프로토콜은 간략하게 설명됩니다. 자세한 내용은 자세한 프로토콜17을 참조하십시오. 모든 MAB 미디어는 사용하기 전에 37°C로 가열되어야 합니다. 생검 조직을 다진 콜라겐(송아지 피부에서)은 2주 동안 성장 배지(표 1)에서 6cm 의 요리를 코팅하였다. 4일마다 매체를 변경합니다. 콜라겐 코팅을 준비하려면 0.1 M 아세트산의 20mL에 콜라겐 100 mg을 녹입니다. 콜라겐은 용해하는 데 시간이 걸리므로 RT에서 밤새 흔들리는 플랫폼에 혼합물을 놓습니다. 다음 날, ddH2O의 80mL를 100mL의 최종 부피로 위로 올려다보며.주의: 아세트산은 독성이 있습니다. 개인 보호 장비가있는 연기 후드에 손잡이.참고: 송아지 가죽 코팅의 콜라겐은 최대 5배까지 재사용할 수 있습니다. 4 °C에 보관하십시오. 접시의 전체 표면이나 플라스크를 콜라겐으로 코팅하고 라미나르 흐름 내부의 RT에서 20 분 동안 닫고 인큐베이션하십시오. 20분 후, 신선한 용기에 콜라겐을 회수하고 빈 접시/플라스크를 닫고 라미나르 흐름의 RT에서 10분 동안 둡니다. 접시/플라스크를 인큐베이터로 하룻밤(또는 최소 6시간) 인큐베이션(37°C, 5% CO2)에 옮기다. 세포를 도금하기 전에 칼슘이나 마그네슘(DPBS) 없이 덜벡코의 인산염 완충식식염으로 5배 세척합니다. 14일 후, FACS(형광 활성 세포 선별)는 인간 알칼리성 인산염17 을 위해 MAB를 정렬한 다음 추가 확장이 뒤따릅니다. 콜라겐 코팅 T75 플라스크에 대한 MAB를 성장 배지에서 유지하고 2일마다 성장 배지를 변경합니다(플라스크당 10mL). 70%의 합류에 도달할 때 기기에서 냉동 보존, 통로 또는 종자 MAB를 종자.참고: MABs는 세포 대 세포 접촉시 자발적인 융합으로 인해 근생 잠재력을 잃습니다. MAB를 확장할 때 70%의 합류를 초과하지 않도록 하십시오. 1개의 70% confluent T75 플라스크는 약 600,000-800,000개의 세포를 포함하고 있으며, 이는 유리병 당 100,000개의 세포에서 냉동 보존될 수 있습니다. 각 바이알은 나중에 해동하여 확장을 위해 T75 플라스크에 씨를 뿌린 다수 있습니다. MAB를 통과하려면, 부드럽게 DPBS의 7 mL로 한 번 세척한 다음 세포를 해리하기 위해 5 % CO2 에서 3 7 분 동안 MAB 해리 용액7 mL로 배양합니다. 성장 배지의 7mL로 MAB 해리 용액을 중화시키고, 세포를 부드럽게 긁어내고, 세포 현탁액을 50mL 원심분리기 튜브로 이송한다. 잠재적으로 남은 MAB를 수집하기 위해 성장 매체의 5mL를 추가로 부드럽게 씻으십시오. 300 x g에서 3 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리한 다음 확장을 위해 새로운 콜라겐 코팅 T75 플라스크로 직접 통과, 10 % DMSO로 녹아웃 혈청 교체에서 냉동 보존 또는 미세 유체 장치에서 씨앗에 계산.참고: 구절은 최대 통과 수13까지 셀 확장을 위해 주당 1x-2배수행됩니다. 해리시, MABs는 현미경의 밑에 검토될 때 구형 및 큰 모양으로 나타납니다. 3. 사전 조립 된 미세 유체 장치의 준비 – 9 일 참고: 이 프로토콜은 미세 유체 장치 제조업체의 뉴런 장치 프로토콜에서 적용되었으며 사전 조립 및 실리콘 장치를 모두 사용하기 위해 조정되었습니다. 여기서, 사전 조립된 장치는 면역 세포 화학 (ICC) 및 살아있는 세포 칼슘 과도 기록에 사용되며 실리콘 장치는 SEM에 사용됩니다. 프로토콜의 타임라인은 모터 뉴런 분화 프로토콜에 대한 타임라인을 따릅니다. 코팅이 하룻밤 동안 배양해야하기 때문에 종자 세포가 종자하기 전날 미세 유체 장치를 준비하십시오. 모터 뉴런 프로토콜에 따르면, 이것은 수요일이 될 것입니다. 페트리 접시에 70%-100% 에탄올의 ~10mL를 넣습니다. 집게를 사용하여 선적 용기에서 페트리 접시로 장치를 전송하여 멸균합니다. 장치를 에탄올에 10초 동안 잠수하고 집게로 장치를 종이로 전송하여 -30분 동안 라미나르 흐름에서 공기 건조시합니다. 장치를 몇 번 뒤집어 양쪽이 건조할 수 있도록 합니다. 장치가 건조하면 집게를 사용하여 각 장치를 개별 10cm 페트리 접시로 이동하여 쉽게 취급할 수 있습니다.주의: 에탄올은 독성이 있습니다. 개인 보호 장비가있는 연기 후드의 손잡이 DPBS에서 폴리-L-오르니틴(PLO)(100 μg/mL)으로 장치를 코팅하고 37°C에서 인큐베이션, 3시간 동안 5% CO2 를 배양한다. P200 파이펫을 사용하여 DPBS 상단에 100 μL의 PLO를 추가하고 가능한 한 채널 개구부에 가깝고 채널을 통해 위쪽에서 잘 통과하는 유체를 잘 관찰합니다. 그 후 DPBS에 PLO 100 μL을 잘 넣습니다. 마이크로그루브의 반대편에서 반복하고 장치의 한쪽에 100 μL을 추가하여 마이크로그루브(예를 들어, 오른쪽 200 μL, 왼쪽 300 μL)를 코팅하는 장치의 두 미러 측 사이의 체적 그라데이션을 생성합니다. 3 시간 후, DPBS로 5 분 동안 장치를 3 배 세척하십시오. 필요한 경우 흡입 시스템을 사용합니다.참고: 세포의 코팅 또는 배양 중에 채널의 기포 형성을 피하십시오. 작은 거품조차도 짧은 시간 동안 확장되어 코팅, 세포 파종 또는 채널 전체의 미디어 흐름을 억제합니다. 코팅 중에 유체가 채널에서 멈추면 PLO 용액을 양쪽에서 채널로 직접 재보선합니다. 기포가 여전히 존재하는 경우, DPBS의 200 μL을 사용하여 채널을 플러시하고 3.3.1-3.3.2 단계에서 위에서 언급한 대로 코팅 공정을 반복하십시오. 세포 파종 후 거품이 나타나면 채널을 플러싱하면 셀이 손상되기 때문에 장치를 복구하는 것은 불가능합니다. 신경물질 배지에 라미닌(20 μg/mL)으로 장치를 코팅하고 37°C, 5% CO2에서 하룻밤 동안 배양한다. 3.3.1-3.3.2 단계에서 PLO 코팅에 대한 동일한 지침을 따르십시오. 다음 날, P200 파이펫을 사용하고 우물에서 라미닌 코팅을 제거하기 위해 채널 개구부와 반대되는 우물에 팁을 배치한다. 모든 우물에 DPBS를 추가하고 셀 파싱을 위해 RT의 라미나르 흐름에 DPBS를 사용하여 장치를 둡니다.참고: 이 시점부터는 기포 형성을 유발할 수 있으므로 채널에서 직접 액체(라미닌 코팅, DPBS, 미디어, 고정 용액 등)를 제거하지 않는 것이 중요합니다. 세포를 파종하기 전에 현미경으로 장치를 항상 검사하십시오. 4. 실리콘 미세 유체 장치의 준비 – 9 일 코팅이 하룻밤 동안 배양해야하므로 세포를 파종하기 전날 실리콘 미세 유체 장치를 준비하십시오. 모터 뉴런 프로토콜에 따르면, 이것은 수요일이 될 것입니다. 페트리 접시에 70%-100% 에탄올의 ~10mL를 넣습니다. 집게를 사용하여 선적 용기에서 페트리 접시로 장치를 전송하여 멸균합니다. 장치를 10초 동안 에탄올에 담그고 6웰 플레이트에서 잘 포셉으로 이송하여 라미나 유동에서 30분 동안 공기건조시다. 모든 면이 건조 할 수 있도록 측면에 장치를 배치합니다. SEM 시트를 장치의 크기로 줄입니다(양쪽에 몇 mm를 남겨 둡니다). 상기 4.1.1 단계에서 위에서 언급한 바와 같이 살균을 반복한다. 그런 다음, 10cm 페트리 접시에 집게로 전달하여 건조시다. 2-3 SEM 시트는 하나의 접시에 맞습니다. DPBS에서 PLO(100 μg/mL)로 장치 및 SEM 시트를 코팅하고 37°C에서 인큐베이션, 3h에 5% CO2 를 배양한다. 6웰 플레이트의 각 장치에 잘 DPBS에 1mL의 PLO를 추가합니다. 장치가 채널과 마이크로그루브 면이 액체를 아래로 향하여 PLO 용액 위에 떠 있는지 확인합니다. 10cm 페트리 접시당 DPBS에 10mL의 PLO를 추가하고 집게를 사용하여 SEM 시트를 액체로 밀어 넣습니다.참고: SEM 시트는 일반적으로 코팅 용액 위에 떠 있습니다. 장치와 시트를 조립하기 전에 PLO와 접촉한 표면이 장치의 채널 및 마이크로그루브 표면에 접촉할 수 있도록 SEM 시트를 돌립니다. 3 시간 후, DPBS로 5 분 동안 장치와 SEM 시트 2x를 세척한 다음 멸균 물로 5 분 동안 다시 씻습니다. 필요한 경우 흡입 시스템을 사용합니다. 각 SEM 시트를 개별 10cm 페트리 접시에 전달하여 손쉽게 취급할 수 있습니다.참고: 장치와 SEM 시트 모두 조립 전에 완전히 건조해야 합니다. 멸균물로 최종 세척하면 DPBS에서 잠재적인 소금 결정을 제거하여 조립을 방해할 수 있습니다. 라미나르 흐름의 현미경으로 작업하십시오. 집게를 사용하여 채널과 마이크로그루브 면을 SEM 시트에 90° 각도로 아래로 장착하여 모든 면이 정렬되도록 합니다. 장치를 가볍게 눌러 외부 가장자리뿐만 아니라 우물, 채널 및 마이크로 홈 을 밀봉해야합니다.참고: 본딩 영역은 회색으로 나타나고 아직 장착되지 않은 영역은 현미경으로 명확하게 나타납니다. 모든 영역이 기포 없이 잘 밀봉되어 있는지 확인하여 배양 중에 장치의 분리를 방지하십시오. 이물질이나 소금 결정이 장착을 차단하는 경우, SEM 시트와 장치를 멸균물로 재세척하고 장착 절차를 다시 시도하기 전에 건조시. 마이크로그루브가 장치에서 너무 세게 누르는 것으로 왜곡된 것처럼 보이면 SEM 시트에서 장치를 완전히 제거하고 마운팅을 다시 시도합니다. 장치가 장착되면 용지를 코팅하고 변경할 때주의하십시오. 라미나르 흐름의 현미경으로 작업하십시오. 신경물질 배지에 라미닌(20 μg/mL)으로 장치를 코팅하고 37°C, 5% CO2에서 하룻밤 동안 배양한다.참고: 하룻밤 잠복은 실리콘 장치를 강화하고 SEM 시트에 더 밀봉합니다. P200 파이펫을 사용하여 상단에 라미닌 용액의 100 μL을 추가하고 가능한 한 채널 개구부에 가깝고 채널을 통해 위쪽에서 잘 통과하는 유체를 잘 관찰합니다. 우물과 채널 주위에 누출을 확인합니다. 그 후, 100 μL의 라미닌 용액을 바닥에 잘 넣고 누설을 확인합니다. 마이크로그루브의 반대편에서 반복하고 장치의 한쪽에 100 μL을 추가하여 마이크로그루브(예를 들어, 오른쪽 200 μL, 왼쪽 300 μL)를 코팅합니다.참고: 누설시 라미닌 코팅을 제거하고 장치와 SEM 시트를 분해하고 멸균 수로 모두 세척하십시오. 4.3 단계에서 건조하고 반복하십시오. 다음 날, 채널 개구부 맞은편에 팁을 배치하여 P200 파이펫으로 우물에서 코팅을 제거합니다. 모든 우물에 DPBS를 추가하고 셀 파싱을 위해 RT의 라미나르 흐름에 DPBS를 사용하여 장치를 둡니다.참고: 이 시점부터는 기포 형성을 유발할 수 있으므로 채널에서 직접 액체(라미닌 코팅, DPBS, 미디어, 고정 용액 등)를 제거하지 마십시오. 세포를 파종하기 전에 현미경으로 장치를 항상 검사하십시오. 5. 미세 유체 장치에서 NPC도금 – 10 일 참고 : 모터 뉴런 분화 프로토콜15에 따르면, 일 10 NPC의 도금은 목요일에 발생합니다. 신선하게 해리된 날 10 NPc15를 사용하거나, 10mL당 뱅크된 NPC의 1-2 바이알을 10mL당 10mL(표 2 및 표 3)로 ROCK 억제제(10 μL/mL) 용액으로 사용하고, 세포 현탁액을 100 x g 에서 4분 동안 원심분리한다. ROCK 억제제(10 μL/mL) 용액을 사용하여 하루 10개의 모터 뉴런 배지의 500-1000 μL에서 세포 펠릿을 재보중단하고 선호하는 계수 방법을 사용하여 살아있는 세포를 계산한다.참고: 아래에 명시된 바와 같이 최적의 시드 볼륨을 수용하기 위해 NPC를 올바른 양의 미디어로 다시 일시 중단해야 합니다. P200 파이펫을 장착한 장치의 마이크로홈 의 한쪽에 있는 두 개의 우물에서 DPBS를 제거하고 10일 모터 뉴런 미디어의 60-100 μL에서 장치당 250,000NPC를 시드한다. 오른쪽 상단에있는 셀 서스펜션 (125,000 셀)의 시드 30-50 μL은 45 ° 각도로 채널 개구부에 가까운 파이펫 팁으로 우물의 중심을 향해 나머지 유체를 부드럽게 드래그합니다. 셀 서스펜션이 채널을 통해 흐를 수 있도록 몇 초 동안 일시 중지한 후 하부 우물(30-50 μL의 125,000세포)에서 이를 반복합니다. 펜을 사용하여 시드 측 “NPC” 또는 이에 상응하는 표시를 사용하여 현미경없이 장치의 쉬운 방향을 설정합니다. 장치를 37°C, 5% CO2 에서 5분 동안 배양하여 2종웰을 추가로 10일 모터 뉴런 배지(총 200 μL/well)로 토핑하기 전에 세포 부착을 허용하고 37°C, 5% CO2에서 다시 배양한다.참고: 각 우물에는 우물과 채널 모두에서 200 μL. 시드 셀이 포함될 수 있으며, 이는 배지 변화 시 세포 분리의 위험을 낮춰 배양의 견고한 구조를 보장합니다. 단지 채널에서 적은 세포를 시드 할 수 있습니다. 그러나 이렇게 하면 각 중간 변경 중에 채널을 통해 볼륨 전류에 문화가 더 취약해집니다. P200 파이펫을 사용하여 갓 시드된 NPC 맞은편에 있는 두 개의 우물에서 DPBS를 제거합니다. 이어서, 배양 중 배지의 증발을 방지하기 위해 장치 주위에 10cm 접시당 DPBS 6mL을 추가한다.참고: 필요한 경우 배양 기간 동안 장치 주위에 DPBS를 추가합니다. 11일(금), 14일(월), 16일(수) (표 2 및 표 3)에 두 구획모두에서 전체 모터 뉴런 중간 변화를 수행한다. 중간 변화의 날에 신선한 미디어 보충제를 추가합니다.참고: 이 시점부터 P200 파이펫으로 모든 중간 변경 사항을 수행합니다. 항상 파이펫 팁을 우물 가장자리의 채널에서 멀리 배치하고 채널에서 직접 액체를 제거하지 않습니다. 실리콘 장치를 분리하지 않도록주의하십시오. 매체를 제거하고 추가하려면 세포 분리를 방지하기 위해 천천히 수행해야 합니다. 채널 열기 맞은편 웰 월의 하단 가장자리에 P200 파이펫 팁을 배치하여 NPC와 함께 두 우물의 모든 미디어를 신중하게 제거합니다. 채널 개구부 맞은편 웰 월의 상단 가장자리에 P200 파이펫 팁을 배치하여 신선한 모터 뉴런 배지의 50-100 μL을 천천히 상단에 배치합니다. 몇 초 동안 일시 중지하여 배지가 채널을 통해 흐를 수 있도록 한 후 모터 뉴런 배지의 50-100 μL을 바닥에 잘 추가합니다. 두 우물이 200 μL/웰을 포함할 때까지 이 과정을 신중하게 반복합니다. 셀없이 측면에 반복합니다. 6. 미세 유체 장치에서 MAB의 도금 – 17 일 약 7일 전에 미세유체 장치(운동 뉴런 분화의 10일째)에서 MAB를 해동하고 콜라겐으로 코팅된 T75 플라스크에서 성장 매체(표 1)에서 종자해하여 충분한 세포 확장을 가능하게 한다. 섹션 2를 참조하십시오. 17일 운동뉴런 분화(Thursday)의 날, 단계 2.4에서 설명된 바와 같이 MAB를 해리시키고, 성장 배지의 ~500 μL에서 세포 펠릿을 재보중단하고 임의의 바람직한 계수 방법을 사용하여 살아있는 세포를 계산한다.참고: 아래에 명시된 바와 같이 최적의 시드 볼륨을 수용하기 위해 MAB를 올바른 양의 매체로 다시 일시 중단해야 합니다. P200 파이펫을 가진 장치에서 마이크로그루브의 시드되지 않은 측의 모터 뉴런 배지를 제거하고 DPBS로 부드럽게 세척하고, 60-100 μL의 성장 배지에서 장치당 200,000 MABs를 시드한다. 오른쪽 상단에는 45° 각도로 채널 개구부에 가까운 셀 서스펜션(100,000셀)의 30-50 μL을 시드하고 파이펫 팁으로 우물 의 중심을 향해 나머지 유체를 부드럽게 드래그합니다. 낮은 우물에서 반복하기 전에 채널을 통해 세포의 흐름을 허용하기 위해 몇 초 동안 일시 중지 (30-50 μL에서 100,000 세포). 장치를 37°C, 5% CO2 에서 5분 동안 배양하여 2개의 갓 MAB 시드 우물을 추가 성장 배지(총 200 μL/well)로 토핑하기 전에 세포 부착을 허용합니다. 37°C, 5% CO2에서 다시 배양합니다.참고: 장치의 모터 뉴런 측에서 17일째에는 중간 변화가 필요하지 않습니다. 17일째 이전에 발표된 모터 뉴런 분화 방법에 따른 중간 변화15 는 18일(금)에 수행된다. 7. MAB 구획을 향한 모터 뉴너리의 성장을 촉진하기 위해 체적 및 화학 적 그라데이션의 구현 18일째, 18일째 운동 뉴런 배지(200 μL/웰)를 통해 모터 뉴런 측에서 전체 중간 변화를 수행한다. 5.5.1-5.5.2 단계에서 언급된 중간 변경 사항에 대한 지침을 따르십시오. 장치의 MAB 구획에서 MAB 차별화를 시작합니다(표 2 및 표 4). 소열된 MAB 분화 매체(표 4)를 인간 아그린(200 μL/웰)으로 보충한 예열된 MAB 분화 매체(표 4)를 추가하기 전에 MAB 구획을 DPBS로 한 번 조심스럽게 세척합니다.참고 : MABs는 1 주일의 시간 과정을 통해 융합 된 여러 개의 myotubes를 형성합니다. 21일, 운동 뉴런 분화 프로토콜(월요일)에 따르면, 화학및 체피그라데이션(표 2 및 표 3)을 개시한다. 뇌 유래 신경 영양인(BDNF), 신경세포선 유래 신경영양인자(GDNF) 및 실의 30 ng/mL로 모터 뉴런 기저형 배지 200μL/웰 추가 심뢰구획(이전에 MAB 구획으로 정의됨)에 대한 신경영양인자(CNTF), 인간 아그린(0.01 μg/mL), 라미닌(20 μg/mL). 운동 뉴런 컴파트먼트에 성장 인자 없이 운동 뉴런 기저형 배지(100 μL/well)를 추가합니다. 운동 뉴런 분화의 28일까지 2일마다 7.2단계를 반복한다. 주말에는 미디어 변경이 필요하지 않습니다. 그림 1: 미세 유체 장치에서 모터 단위 프로토콜의 회로도 개요. 모터 뉴런 분화 프로토콜22의 타임라인에 따라 0일부터 28일까지의 분화 타임라인 및 공동 배양 개요. iPSC로부터의 운동 뉴런 분화는 0일째에 시작되어 다음 10일 15일에 대해 이전에 명시된 대로 수행된다. 9일째에 이 장치는 살균되어 PLO-laminin으로 코팅됩니다. MAB는 T75 플라스크에서 확장을 위해 해동됩니다. 10일째되는 날, 모터 뉴런-NPC는 우물과 장치의 하나의 구획(라이트 그레이)의 채널모두에서 도금되며, 여기서 모터 뉴런으로의 차별화가 일주일 동안 계속된다. MAB는 17일째에 우물과 반대 구획(다크 그레이)의 채널모두에서 도금됩니다. 18일째, MAB는 myotubes로 의차별화가 시작되었습니다. 21일, 장치의 마이크로그루브를 통해 운동 뉴런-중성염 편광을 촉진하기 위해 체피 및 화학적 그라데이션이 설치된다. 모터 뉴런 컴파트먼트는 성장 인자(밝은 녹색 구획)가 없는 모터 뉴런 기저 배지 100μL/웰을 받았으며, 심오튜브 컴파트먼트는 30ng/mL의 성장 인자(다크 그린 컴파트먼트)(표 2 및 표 3)를 갖춘 모터 뉴런 기저배지 200μL/웰을 받았다. 배양은 28일째분석전까지 7일 동안 체피 및 화학적 그라데이션으로 계속된다. 밝은 필드 이미지는 0일, 11일, 18일, 28일째에 사전 조립된 미세유체 장치에서 배양된 세포 형태를 보여줍니다. 스케일 바, 100 μm. 이 수치는 스토클룬드 디틀라우, K. 외.18에서 수정되었습니다. 셀 일러스트레이션은 스마트 서버 의료 Art22에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 8. 고정 및 ICC 참고: 모든 단계는 신경 배양의 분리를 방지하기 위해 신중하게 수행해야합니다. 다음 단계에서채널에서 액체를 제거하지 마십시오. 연기 후드 또는 라미나르 흐름에 고정을 수행 : 신중하게 고정하기 전에 DPBS와 함께 한 번 장치의 모든 우물을 세척. 라미나르 흐름(100 μL/웰)에서 RT에서 15-20분 동안 DPBS에서 4% 파라포름데히드(PFA)를 사용하여 수정합니다.주의 : PFA는 독성 : 개인 보호 장비와 연기 후드에 핸들. 조심스럽게 장치의 상단 우물에 100 μL을 추가하고 고정 솔루션이 잘 바닥에 100 μL을 추가하기 전에 채널을 통해 흐를 수 있도록 몇 초 기다립니다. 다른 쪽에서 반복합니다. 인큐베이션 후 PFA 용액을 제거하고 DPBS로 5 분 동안 3 배 부드럽게 씻으십시오. 200 μL/well DPBS를 보관하고 ICC 실험전까지 4°C에 보관할 파라필름으로 10cm 페트리 접시를 밀봉하십시오.참고: 저장 중에 장치가 건조되지 않도록 하십시오. ICC 절차의 첫날 RT에서 20 분 동안 DPBS에서 0.1 % 트리톤 X-100의 투과 성액 (100 μL /well)으로 세포를 배양합니다. 투과성 용액을 제거하고 RT에서 30분 동안 0.1% 트리톤 X-100/DPBS 용액(100 μL/well)에 5% 일반 당나귀 세럼을 추가합니다. 5% 일반 당나귀 혈청 용액을 제거하고, 0.1% Triton X-100/DPBS 용액으로 2% 정상 당나귀 혈청에서 1차 항체(재료표)를 가진 장치를 배양하고 하룻밤 사이에 4°C에서 배양한다. 볼륨 그라데이션을 구현합니다. 마이크로그루브의 한쪽에 100 μL/웰의 항체 용액을 추가하고 다른 쪽에는 150 μL/잘 넣습니다(장치당 총 500μL).참고: 마이크로홈의 양쪽에 상이한 항체를 사용할 수 있습니다. 이 경우, 구획 간의 유체 절연을 유지하기 위해 마이크로홈을 가로질러 1차 또는 이차 항체를 사용하여 체적 그라데이션을 구현하지 마십시오. 마이크로그루브의 중성염은 그라데이션 없이 염색되지 않습니다. 다음 날(ICC 절차의 2일차)은 1차 항체를 제거하고 0.1% 트리톤 X-100/DPBS 용액으로 5분 동안 3배의 장치를 조심스럽게 세척한다.참고: 쉽게 분리할 수 있는 문화권에서는 3×5분 동안 3배세탁을 30분 동안 1x로 교체할 수 있습니다. 이차 항체 (재료의 표)가 빛에 민감하기 때문에 지금부터 어둠 속에서 작용하십시오. RT에서 1h에 대해 0.1% Triton X-100/DPBS 용액으로 2% 정상 당나귀 혈청에서 이차 항체를 가진 세포를 배양하여 8.3.1 단계에서 명시된 바와 같이 체적 그라데이션을 구현한다. 인큐베이션 후, 이차 항체를 제거하고 DPBS로 5 분 동안 3 배 세척하십시오. DPBS(100 μL/well)에서 DAPI로 핵 DNA를 라벨로 표시하여 RT에서 20분 동안 3x-4x의 5분 세척을 5분 동안 3x-4x로 팅톤 X-100/DPBS 용액으로 분류합니다. 모든 우물에서 0.1% 트리톤 X-100/DPBS 용액을 제거하고 각 웰에 형광 장착 미디어를 한 방울 추가하기 전에 배양이 몇 초 동안 건조하게 하십시오.참고: 장착 미디어를 설정할 수 있도록 장치를 24시간 이상 수평으로 유지합니다. 24시간 후, 장치는 4°C에서 슬라이드 케이스에 저장될 수 있다. 반전 된 현미경으로 z 스택의 이미지. NMJ를 이미지하려면 40배 의 목표를 사용하여 심튜브 항체(재료 표)로 표시된 심튜브를 찾고 z 스택 레코딩을 수행하여 신경 및 심피튜브 조직 이미징을 보장합니다. myotube가 너무 커서 단일 프레임에 들어갈 수 없을 때 여러 이미지를 가져 가라. NMJ 정량화의 경우, 각 z-스택을 통해 신경 전시냅스 마커와 AChR 마커 사이의 공동 국소화 수를 수동으로 계산합니다. z 스택에 존재하는 myotube의 수로 공동 지역화 수를 정규화합니다. 9. SEM용 장치의 고정 및 준비 참고: 액체를 변경할 때는 항상 소량의 양을 유지하여 세포 붕괴를 방지합니다. 이 프로토콜은 매우 독성이 강한 물질을 사용하며, 전체 과정에서 개인 보호 장비와 연기 후드로 작업해야 합니다. 고정 및 분해: 0.1M 나트륨 카코딜레이트 버퍼(pH 7.6)로 신선한 2.5% 글루타랄데히드(GA)를 준비하고, 0.2 μm 필터를 사용하는 필터를 넣고, 최대 37°C까지 가열한다.주의: GA와 나트륨 cacodylate는 독성: 개인 보호 장비와 연기 후드에 핸들. 조심스럽게 DPBS와 함께 장치를 한 번 세척하여 미디어 및 세포 이물질을 제거한 다음 RT에서 15 분 동안 GA 용액으로 접두사하십시오. 메스를 사용하여 SEM 시트를 장치 둘레로 조심스럽게 자르면서 장치를 집게로 안정시하십시오. 절단하는 동안 장치를 분리하지 않도록 하십시오. 3cm 페트리 접시에 집게의 도움으로 장치와 SEM 시트를 이동하고 쉽게 취급할 수 있도록 10cm 접시에 3cm 접시를 배치합니다. 접두사 후 15분 동안 집게를 사용하여 SEM 시트에서 장치를 조심스럽게 제거합니다. 장치를 한 쪽 구석에 분리하고 반대쪽 모서리를 향해 대각선 방향으로 천천히 제거합니다. 장치에서 분리된 셀을 관찰합니다. 추가 GA 용액을 추가하여 3cm 접시에 전체 SEM 시트를 덮고 RT 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 총 2 시간 동안 고정을 계속합니다.참고: 세포로 덮인 표면을 피하여 집게로 GA 솔루션 아래에 SEM 시트를 부드럽게 밀어 넣습니다. SEM에 대한 표준 프로토콜을 계속 합니다. 간단히 말해서, 오스뮴 테트옥사이드에서 배양한 다음 등급이 매겨진 일련의 에탄올로 탈수합니다. SEM 시트를 커버슬립 홀더에 삽입하여 중요한 점 건조를 위해 탄소 스티커 및 코팅을 위한 지지 스텁에 장착합니다. 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 5 kV의 가속 전압과 7mm의 작동 거리를 이미지합니다. 10. 라이브 셀 칼슘 이미징을 사용하여 NMJ 기능 평가 장치 준비: BDNF, GDNF 및 CNTF의 30 ng/mL및 운동 뉴런 컴파트먼트가 있는 200 μL/well의 18일 모터 뉴런 기저 배지로 심오튜브 구획을 새로 고침하고 성장 인자 없이 200 μL/웰 모터 뉴런 기저 배지(표 2 및 표 3). 플루오-4 염료를 5μM의 최종 농도로 근튜브 컴파트먼트에 플루오-4 염료를 첨가하고 37°C, 25분 동안 5% CO2 에서 어두운 장치를 배양한다. 장치가 인큐베이션을 받고 있는 동안, 450 mMM의 최종 농도에서 성장 인자없이 운동 뉴런 기저 배지에서 염화칼륨을 희석시하십시오.참고: 플루오-4 AM은 칼슘 변성에 대한 형광증가를 나타내는 칼슘 지표입니다. 염료가 빛에 민감하기 때문에 지금부터 어둠 속에서 작업하십시오. 25분 후, BDNF, GDNF 및 CNTF의 30 ng/mL및 운동 뉴런 구획의 30 ng/mL로 200 μL/well의 18운동 뉴런 기저배지로 심튜브 구획을 새로 고치고, 성장 인자 없이 100μL/웰의 모터 뉴런 기저 배지를 사용하여 화학및 체피그라데이션을 재확립한다. NMJ를 차단하려면 AChR 경쟁 적대행위 튜부쿠라린 염산염 펜타하이드레이트의 19 μM으로 심우전지 구획 매체를 보완하십시오.주의: 투부쿠라린 염산염 펜타하이드레이트독성: 개인 보호 장비가 있는 연기 후드에 손잡이. 37°C, 5% CO2로 조정된 인큐베이터를 장착한 반전된 공초점 현미경으로 레코딩을 수행합니다. 10배 의 목표를 통해 밝은 필드 채널을 사용하여 myotube 구획에서 myotube를 찾습니다. 488 채널의 레이저 전력, 게인 및 오프셋을 플루오-4 형광이 개별 심덩이를 표시하는 수준으로 조정합니다.참고: 소프트웨어의 A1 설정에서 스크롤 막대를 레이저 전력 5%, 이득 60(HV) 및 0의 오프셋으로 조정하여 대표적인 결과를 얻었습니다. 1 간격으로 녹화 시간을 1분으로 설정합니다. 5-10s가 기준선을 가지고 있고, 염화칼륨 용액으로 모터 뉴런을 즉시 자극하는 기록을 기록합니다. 5-10s의 레코딩 후, 50mMM의 최종 농도에 도달하기 위해 모터 뉴런 컴파트먼트의 한 웰에 25 μL의 염화칼륨 용액을 천천히 추가합니다.참고: 염화칼륨 용액을 너무 빨리 추가하지 마십시오. 운동 신경 자극이 2분 정지된 후, 운동 신경 탈극화와 무관하게 직접 심튜브 활동을 평가하기 위해 심오튜브 구획의 25 μL 칼륨 염화액을 직접 자극하여 운동 뉴런 자극으로 심오튜브 구획을 기록합니다. 정량화의 경우, 각 myotube를 기록 소프트웨어와 함께 수동으로 동그라미를 치고 1분 동안 형광강도를 분석한다. 칼슘 유입의 증가를 결정하기 위해 염화칼륨을 자극한 후 피크 값에서 평균 기준값(즉, 염화칼륨 자극 전 의 첫 10s에서 평균)을 빼낸다. 대표적인 결과는 소프트웨어의 시간 측정 도구를 사용하여 획득되었습니다.