מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה-רדיוליגנד ורקמה מטופלת (FACS-RTT) הוא כלי רב עוצמה לחקר תפקידו של חלבון טרנסלוקטור 18 kDa או ביטוי קולטן סרוטונין 5HT2A במחלת אלצהיימר בקנה מידה תאי. פרוטוקול זה מתאר את יישום ex-vivo של FACS-RTT במודל חולדות TgF344-AD.
לתאי גליה יש כנראה השלכה ניכרת בפתופיזיולוגיה של הפרעות נוירודגנרטיביות, כגון מחלת אלצהיימר (AD). השינויים שלהם קשורים אולי למצב פרו-דלקתי. זן החולדה TgF344-AD תוכנן לבטא את הגנים האנושיים APP ו-PS1ΔE9 אנושיים, המקודדים עבור חלבוני עמילואיד Aβ-40 ו-Aβ-42 ומציג פתולוגיה של עמילואידים וליקויים קוגניטיביים עם הזדקנות. מודל החולדה TgF344-AD משמש במחקר זה כדי להעריך את המקור התאי של חלבון הטרנסלוקטור 18 kDa (TSPO, סמן להפעלת תאי גליה) הקושר, ואת רמות קולטן הסרוטונין של 5HT2A (5HT2AR) שעלולות להיות מופרעות באלצהיימר. הטכניקה המוצגת כאן היא מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה לרקמות מטופלות רדיוליגנד (FACS-RTT), טכניקה כמותית ספציפית לסוג התא המשלימה לטכניקות אוטורדיוגרפיה של IN vivo PET או SPECT או ex vivo/in vitro . הוא מכמת את אותו עקיבה עם תווית רדיו ששימשה קודם להדמיה, תוך שימוש במונה γ לאחר מיון תאי ציטומטריה. זה מאפשר לקבוע את המקור התאי של החלבון בעל התווית הרדיולית עם ספציפיות תאית גבוהה ורגישות. לדוגמה, מחקרים עם FACS-RTT הראו כי (1) העלייה בקשירת TSPO נקשרה למיקרוגליה במודל חולדה של דלקת עצבית הנגרמת על ידי ליפופוליסכריד (LPS), (ii) עלייה בקשירת TSPO ב-12 ו-18 חודשים נקשרה תחילה לאסטרוציטים, ולאחר מכן למיקרוגליה בחולדות TgF344-AD בהשוואה לחולדות מסוג בר (WT), ו-(iii) צפיפות הסטריאטים של 5HT2A R יורד באסטרוציטים לאחר 18 חודשים באותו מודל AD של חולדה. מעניין, טכניקה זו ניתן להרחיב כמעט לכל radiotracers.
מחלות נוירודגנרטיביות, כגון מחלת אלצהיימר (AD), מאופיינות באובדן עצבי הקשור לתסמינים מוגברים. AD, הגורם השכיח ביותר לדמנציה, המהווה 60%-70% מהמקרים, משפיע על כ -50 מיליון אנשים ברחבי העולם1. ברמה הנוירופתולוגית, שני המאפיינים העיקריים של AD הם הצטברות של רבדים חוץ-תאיים β עמילואיד (Aβ) וסבכים נוירופיברילריים תוך תאיים של טאו. שינויים בתאי גליה נקשרו גם ל-AD2 ולהפרעה אפשרית של מספר מערכות מוליכים עצביים 3,4.
קו העכברושים TgF344-AD שונה למודל AD על ידי ביטוי טרנסג’נים אנושיים של APP ו-PS1ΔE9, מה שמוביל לביטוי Aβ-40 ו-Aβ-42 מסיסים ובלתי מסיסים ולהיווצרות רובד עמילואיד5. הוא גם מציג את הצטברות הצורות ההיפר-פוספוריות של חלבון הטאו המובילות לטאופתיה. מגיל 9-24 חודשים, החולדות מפתחות בהדרגה את סימני ההיכר הפתולוגיים של אלצהיימר ופגיעה קוגניטיבית 5,6,7,8,9.
טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET), טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון יחיד (SPECT) ואוטורדיוגרפיה הן טכניקות המבוססות על פליטה וכימות של קרניים γ. רדיוטראקרים מכמתים את in vivo (PET ו-SPECT) או את ה-ex vivo/in vitro (אוטורדיוגרפיה). טכניקות רגישות אלה תרמו להבנת מנגנונים של מספר מחלות מוח, כגון אלצהיימר. ואכן, במונחים של דלקת עצבית, ישנם מחקרים רבים המעריכים 18 kDa Translocator Protein (TSPO), סמן נוירו-דלקתיות in vivo, עם עוקבים עם תווית רדיו כגון [11C]-(R)-PK11195 או [11C]PBR28 (לסקירה ראו10). בנוסף, שינויים של מערכות נוירוטרנסמיטר נחקרו באמצעות radiotracers 11,12,13.
עם זאת, טכניקות אלה אינן קובעות את המקור התאי של האות הרדיואקטיבי. זה עלול לעכב את הפרשנות של היסודות הביולוגיים של השינוי בכריכה של רדיוליגנד ב-PET/SPECT. לדוגמה, במקרה של מחקרי TSPO של דלקת עצבית, ההבנה אם העלייה או הירידה של TSPO נובעת משינויים אסטרוציטיים או מיקרוגליאליים היא בעלת חשיבות עליונה. טכניקת מיון התאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה לרקמות מטופלות של רדיוליגנד (FACS-RTT) פותחה כדי לעקוף את הבעיות הללו, ומאפשרת הערכה של קשירת רדיוליגנד בכל סוג תא בנפרד וכימות צפיפות חלבון המטרה לכל תא. טכניקה חדשנית זו היא אפוא משלימה ותואמת מאוד להדמיית PET ו-SPECT.
כאן, טכניקה זו יושמה לאורך שני צירים: חקר דלקת עצבית באמצעות רדיוליגנדים ספציפיים ל- TSPO והערכת המערכת הסרוטונרגית. בציר הראשון, המטרה הייתה להבין את המקור התאי של אות ה-TSPO בתגובה לתגובה דלקתית חריפה. לכן, FACS-RTT שימש על רקמות המוח של חולדות לאחר אינדוקציה של דלקת עצבית באמצעות הזרקת lipopolysaccharide (LPS) ובעקבות מחקר הדמיה in vivo [125I]CLINDE SPECT. יתר על כן, אותה הדמיה ופרוטוקול FACS-RTT יושמו על חולדות TgF344-AD בנות 12 ו-24 חודשים וחולדות תואמות מסוג בר (WT). הציר השני נועד לקבוע את מקורם של שינויים במערכת הסרוטונין במודל חולדה זה באמצעות הערכת צפיפות ex vivo 5-HT2AR לפי סוג התא.
למיטב ידיעתנו, טכניקה זו הייתה הראשונה שתיארה גישה המאפשרת הבנה טובה יותר של שינויים מחייבי in vivo של רדיוטראקר ברמה התאית. הפרוטוקול מתאר שיטה רב-ממדית לכימות קשירת רדיו-טראקר ברמה התאית באמצעות [125I]CLINDE (TSPO) או [125I]R91150 (5HT2AR) כדוגמאות.
טכניקה זו חזקה ורגיש?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית השוויצרית למדע (מענק מס ‘320030-184713). המחברים BBT ו-KC נתמכים על ידי קרן Velux (פרויקט מס’ 1123). המחבר ST קיבל תמיכה מהקרן הלאומית השוויצרית למדע (מלגת ניידות פוסט-דוקטורט מוקדמת, לא. P2GEP3_191446), קרן פרופ’ מקס קלוטה (מלגת רפואה קלינית פלוס), וקרן ז’אן ומדלן ואצ’ו.
Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
HPLC | Knauer | ||
Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
R91150 précursor | CERMN | ||
Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
Tributylin precursor | CERMN | ||
U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |