Summary

Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortierungs-Radioliganden-behandeltes Gewebe (FACS-RTT) zur Bestimmung des zellulären Ursprungs des radioaktiven Signals

Published: September 10, 2021
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Summary

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Rolle des 18-kDa-Translokatorproteins oder der Serotonin-5HT-2A-Rezeptorexpression bei der Alzheimer-Krankheit auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Ex-vivo-Anwendung von FACS-RTT im Rattenmodell TgF344-AD.

Abstract

Gliazellen haben wahrscheinlich eine erhebliche Bedeutung in der Pathophysiologie neurodegenerativer Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit (AD). Ihre Veränderungen sind vielleicht mit einem entzündungsfördernden Zustand verbunden. Der Rattenstamm TgF344-AD wurde entwickelt, um menschliche APP- und menschliche PS1ΔE9-Gene zu exprimieren, die für die Amyloidproteine Aβ-40 und Aβ-42 kodieren und Amyloidpathologie und kognitive Defizite mit zunehmendem Alter aufweisen. Das TgF344-AD-Rattenmodell wird in dieser Studie verwendet, um den zellulären Ursprung der Bindung des 18-kDa-Translokatorproteins (TSPO, ein Marker für die Aktivierung von Gliazellen) und der Serotoninrezeptorspiegel des5HT 2A-Rezeptors (5HT2A R) zu bewerten, die möglicherweise bei AD gestört sind. Die hier vorgestellte Technik ist Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT), eine quantitative zelltypspezifische Technik, die di vivo PET oder SPECT oder ex vivo/in vitro Autoradiographietechniken ergänzt. Es quantifiziert den gleichen radioaktiv markierten Tracer, der zuvor für die Bildgebung verwendet wurde, unter Verwendung eines γ-Zählers nach der Zellsortierung der Zytometrie. Dies ermöglicht es, den zellulären Ursprung des radioaktiv markierten Proteins mit hoher zellulärer Spezifität und Sensitivität zu bestimmen. Zum Beispiel zeigten Studien mit FACS-RTT, dass (i) die Zunahme der TSPO-Bindung mit Mikroglia in einem Rattenmodell von Lipopolysaccharid (LPS)-induzierten Neuroinflammation assoziiert war, (ii) eine Zunahme der TSPO-Bindung nach 12 und 18 Monaten zuerst mit Astrozyten und dann mit Mikroglia bei den TgF344-AD-Ratten im Vergleich zu Wildtyp-Ratten (WT) assoziiert war, und (iii) die striatale Dichte von 5HT2A R nimmt in Astrozyten nach 18 Monaten im selben Ratten-AD-Modell ab. Interessanterweise kann diese Technik auf praktisch alle Radiotracer ausgedehnt werden.

Introduction

Neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimer-Krankheit (AD) sind durch einen neuronalen Verlust gekennzeichnet, der mit erhöhten Symptomen einhergeht. AD, die häufigste Ursache für Demenz, die 60% -70% der Fälle ausmacht, betrifft weltweit rund 50 Millionen Menschen1. Auf neuropathologischer Ebene sind die beiden Hauptmerkmale von AD die Ansammlung von extrazellulären Amyloid-β (Aβ) -Plaques und intrazellulären Tau-Neurofibrillenverwicklungen. Gliazellveränderungen wurden auch mit AD2 und einer möglichen Störung mehrerer Neurotransmittersysteme in Verbindung gebracht 3,4.

Die TgF344-AD-Rattenlinie wurde modifiziert, um AD zu modellieren, indem humane APP- und PS1ΔE9-Transgene exprimiert wurden, was zu einer löslichen und unlöslichen Aβ-40- und Aβ-42-Expression und Amyloid-Plaquebildungführte 5. Es zeigt auch die Anhäufung von hyperphosphorylierten Formen des Tau-Proteins, die zur Tauopathie führen. Ab dem Alter von 9-24 Monaten entwickeln die Ratten allmählich die pathologischen Merkmale von AD und eine kognitive Beeinträchtigung 5,6,7,8,9.

Positronen-Emissions-Tomographie (PET), Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) und Autoradiographie sind Techniken, die auf der Emission und Quantifizierung von γ Strahlen basieren. Radiotracer werden entweder in vivo (PET und SPECT) oder ex vivo/in vitro (Autoradiographie) quantifiziert. Diese empfindlichen Techniken haben zum Verständnis der Mechanismen verschiedener Gehirnerkrankungen wie AD beigetragen. Tatsächlich gibt es in Bezug auf Neuroinflammation viele Studien, in denen 18 kDa Translocator Protein (TSPO), ein in vivo Neuroinflammation Marker, mit radioaktiv markierten Tracern wie [11 C]-(R)-PK11195 oder [11C]PBR28 bewertet wird (zur Überprüfung siehe 10). Darüber hinaus wurden Veränderungen von Neurotransmittersystemen mit Radiotracern11,12,13 untersucht.

Diese Techniken bestimmen jedoch nicht den zellulären Ursprung des radioaktiven Signals. Dies könnte die Interpretation der biologischen Grundlagen der Veränderung der Bindung eines Radioliganden in PET/SPECT behindern. Im Falle von TSPO-Studien zur Neuroinflammation ist es beispielsweise von größter Bedeutung zu verstehen, ob der Anstieg oder Rückgang des TSPO auf astrozytäre oder mikrogliale Veränderungen zurückzuführen ist. Die FACS-RTT-Technik (Fluorescence-Activated Cell Sorting to Radioligand Treated Tissue) wurde entwickelt, um diese Probleme zu umgehen und die Beurteilung der Radioligandenbindung in jedem Zelltyp separat und die Quantifizierung der Zielproteindichte pro Zelle zu ermöglichen. Diese innovative Technik ist daher komplementär und hochgradig kompatibel mit PET- und SPECT-Bildgebung.

Hier wurde diese Technik entlang zweier Achsen angewendet: der Untersuchung der Neuroinflammation mit TSPO-spezifischen Radioliganden und der Beurteilung des serotonergen Systems. Auf der ersten Achse ging es darum, den zellulären Ursprung des TSPO-Signals als Reaktion auf eine akute Entzündungsreaktion zu verstehen. Daher wurde FACS-RTT am Hirngewebe von Ratten nach der Induktion einer Neuroinflammation über eine Lipopolysaccharid (LPS) -Injektion und nach einer in vivo [125I]CLINDE SPECT Bildgebungsstudie eingesetzt. Darüber hinaus wurden die gleiche Bildgebung und das FACS-RTT-Protokoll auf 12 und 24 Monate alte TgF344-AD-Ratten und passende Wildtyp-Ratten (WT) angewendet. Die zweite Achse zielte darauf ab, den Ursprung serotoninerger Systemveränderungen in diesem Rattenmodell durch ex vivo 5-HT2AR Dichtebewertung nach Zelltyp zu bestimmen.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren wurden in Absprache mit der Ethikkommission für Menschen- und Tierversuche des Kantons Genf, der Kantonalen Kommission für Forschungsethik (CCER) bzw. der Allgemeinen Gesundheitsdirektion des Kantons Genf (Schweiz) durchgeführt. Die Daten werden gemäß den Richtlinien von Animal Research: Reporting In-vivo Experiments (ARRIVE) gemeldet. 1. Vorbereitung und Kalibrierung der SPECT-Kamera Schalten Sie die Kamera ein, laden Sie die Bediensoftwa…

Representative Results

WT-Ratten erlebten einen vivo SPECT-Scan mit [125I]CLINDE Radiotracer nach einer einseitigen LPS-Injektion (Abbildung 2). Dieser Scan (unter Verwendung summierter Daten aus Bildern von 45-60 min nach der Radiotracer-Injektion) zeigte eine höhere Bindung von [125I]CLINDE an der Stelle der LPS-Injektion (Abbildung 2A) als in der kontralateralen Region des Gehirns (Abbildung 2B). Die Ex-vivo-Proben</…

Discussion

Unseres Wissens war diese Technik die erste, die einen Ansatz beschrieb, der ein besseres Verständnis von in vivo bindenden Veränderungen eines Radiotracers auf zellulärer Ebene ermöglicht. Das Protokoll beschreibt eine Multiskalenmethode zur Quantifizierung der Radiotracerbindung auf zellulärer Ebene am Beispiel von [125I]CLINDE (TSPO) oder [125I]R91150 (5HT2AR).

Diese Technik ist robust und empfindlich genug, um den zellulären Ursprung eines br…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds (Förderkennzeichen 320030-184713) unterstützt. Die Autoren BBT und KC werden von der Velux Foundation (Projekt Nr. 1123) unterstützt. Autor ST erhielt Unterstützung vom Schweizerischen Nationalfonds (Early Post-Doc Mobility Scholarship, Nr. P2GEP3_191446), die Prof. Dr. Max Cloetta Foundation (Clinical Medicine Plus Stipendium) und die Jean and Madeleine Vachoux Foundation.

Materials

Acetic acid Sigma-Aldrich
Acetonitrile Sigma-Aldrich
BioVet BioVet Software for vitals check
Bondclone C18 reverse-phase column Phenomenex, Schlieren, Switzerland
Des-Sur University Hospital of Geneva Virucide
Fc Block / anti-CD32 BD Biosciences BDB550270 Reactivity for rat
FITC-conjugated anti-rat CD90 Biolegend 202504 Reactivity for rat
Heparin B. Braun B01AB01
HPLC Knauer
Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm BD Biosciences 321312 24 G catheter
Isoflurane Baxter ZDG9623
Lacryvisc Alcon 2160699
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
Micropore soft tape 3M F51DA01
MILabs-Uspect II MILabs Software for SPECT Camera
MoFlo Astrios Beckman Coulter Cell sorter
Myelin Removal Beads II Miltenyi Biotec 130-096-733 Contains beads and myelin removal buffer.
NaCl 0.9% Sterile solution B. Braun 395202
Neural Dissociation Kit (P) Miltenyi Biotec 130-092-628 Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3.
Nylon Mesh Sheet Amazon CMN-0074-10YD 40 inch width, 80 micron size mesh
Peracetic acid Sigma-Aldrich
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
R91150 précursor CERMN
Sep-Pak C18 Column Waters Concentration column
Sodium iodide Na125 PerkinElmer
Tributylin precursor CERMN
U-SPECT Rec2.38c MILabs Version Rec2.38c Software for SPECT images reconstruction
USPECT II MILabs Spect Camera
Wizard 3" PerkinElmer Gamma counter

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Amossé, Q., Ceyzériat, K., Tsartsalis, S., Tournier, B. B., Millet, P. Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal. J. Vis. Exp. (175), e62883, doi:10.3791/62883 (2021).

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