Summary

Une méthode efficace pour l’induction de cellules dirigées de type hépatocytes à partir de cellules souches embryonnaires humaines

Published: May 06, 2021
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Summary

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en cellules fonctionnelles de type hépatocytes (CHN) en complétant continuellement l’activine A et le CHIR99021 pendant la différenciation du CSEh en endoderme définitif (DE).

Abstract

Les fonctions potentielles des cellules de type hépatocytes (CHN) dérivées de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont très prometteuses pour les applications de modélisation des maladies et de dépistage des médicaments. Il est fourni ici une méthode efficace et reproductible pour différencier les CSEh en CSH fonctionnels. L’établissement d’une lignée endodermique est une étape clé dans la différenciation aux HLCs. Par notre méthode, nous régulons les voies de signalisation clés en complétant continuellement l’Activine A et le CHIR99021 lors de la différenciation hESC en endoderme définitif (DE), suivie de la génération de cellules progénitrices hépatiques, et enfin des CHN avec une morphologie hépatocytes typique dans une méthode par étapes avec des réactifs complètement définis. Les HNC dérivés du hESC produits par cette méthode expriment des marqueurs spécifiques au stade (y compris l’albumine, le récepteur nucléaire HNF4α et le polypeptide de cotransport du taurocholate de sodium (NTCP)), et présentent des caractéristiques particulières liées aux hépatocytes matures et fonctionnels (y compris la coloration verte à l’indocyanine, le stockage du glycogène, la coloration à l’hématoxyline-éosine et l’activité CYP3), et peuvent fournir une plate-forme pour le développement d’applications à base de HLC dans l’étude des maladies du foie.

Introduction

Le foie est un organe hautement métabolique qui joue plusieurs rôles, notamment la désoxydation, le stockage du glycogène, la sécrétion et la synthèse des protéines1. Divers agents pathogènes, médicaments et hérédité peuvent provoquer des changements pathologiques dans le foie et affecter ses fonctions2,3. Les hépatocytes, en tant que principale unité fonctionnelle du foie, jouent un rôle important dans les systèmes artificiels de soutien du foie et l’élimination de la toxicité des médicaments. Cependant, la ressource en hépatocytes humains primaires est limitée dans la thérapie cellulaire, ainsi que dans la recherche sur les maladies du foie. Par conséquent, le développement de nouvelles sources d’hépatocytes humains fonctionnels est une direction de recherche importante dans le domaine de la médecine régénérative. Depuis 1998, date à laquelle les CSEh ont étéétablies, 4, les CSEh ont été largement prises en compte par les chercheurs en raison de leur potentiel de différenciation supérieur (ils peuvent se différencier en divers tissus dans un environnement approprié) et de leur haut degré d’autorenouvrabilité, et fournissent ainsi des cellules sources idéales pour les foies bioartificiels, la transplantation d’hépatocytes et même l’ingénierie tissulaire hépatique5.

Actuellement, l’efficacité de la différenciation hépatique peut être considérablement augmentée en enrichissant l’endoderme6. Dans la différenciation de la lignée des cellules souches en endoderme, les niveaux de la signalisation du facteur de croissance transformant β (TGF-β) et des voies de signalisation WNT sont les facteurs clés dans le nœud de l’étape de formation de l’endoderme. L’activation d’un haut niveau de signalisation TGF-β et WNT peut favoriser le développement de l’endoderme7,8. L’activine A est une cytokine appartenant à la superfamille TGF-β. Par conséquent, l’activine A est largement utilisée dans l’induction endodermique de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs) et decsh 9,10. GSK3 est une protéine kinase sérine-thréonine. Les chercheurs ont constaté que CHIR99021, un inhibiteur spécifique de GSK3β, peut stimuler les signaux WNT typiques, et peut promouvoir la différenciation des cellules souches dans certaines conditions, ce qui suggère que CHIR99021 a le potentiel d’induire la différenciation des cellules souches dans l’endoderme 11,12,13.

Ici nous rapportons une méthode efficace et reproductible pour induire efficacement la différenciation des cseh en HLCs fonctionnels. L’addition séquentielle de l’Activine A et du CHIR99021 a produit environ 89,7±0,8 % de cellules SOX17 (marqueur DE) positives. Après avoir été encore maturées in vitro,ces cellules ont exprimé des marqueurs spécifiques hépatiques et exercé hépatocytes-comme la morphologie (basée sur la souillure d’hématoxyline-éosine (H &E)) et les fonctions, telles que l’absorption du vert d’indocyanine (ICG), le stockage de glycogène et l’activité CYP3. Les résultats montrent que les CSEh peuvent être différenciés avec succès en CSH fonctionnels matures par cette méthode et peuvent fournir une base pour la recherche liée aux maladies du foie et le dépistage in vitro des médicaments.

Protocol

1. Maintien des cellules souches REMARQUE: Le protocole de maintenance cellulaire décrit ci-dessous s’applique à la lignée cellulaire hES03 maintenue dans une monocouche adhérente. Pour tous les protocoles suivants dans ce manuscrit, les cellules doivent être manipulées sous une armoire de sécurité biologique. Préparer 1x mTesR de milieu de culture de cellules souches en diluant 5x milieu supplémentaire au milieu de base mTesR. Préparer 30x milieu Matrigel qual…

Representative Results

Le diagramme schématique de l’induction HLC à partir des CSEh et des images représentatives en champ lumineux de chaque étape de différenciation sont illustrés à la figure 1. Au stade I, l’activine A et le CHIR99021 ont été ajoutés pendant 3 jours pour inciter les cellules souches à former des cellules endodermiques. Au stade II, les cellules endodermiques se sont différenciées en cellules progénitrices hépatiques après avoir été traitées avec un milieu de différencia…

Discussion

Ici, nous présentons une méthode par étapes qui induit des CHN à partir de CSEh en trois étapes. Dans la première étape, Activin A et CHIR99021 ont été utilisés pour différencier les CSEh en DE. Dans la deuxième étape, KO-DMEM et DMSO ont été utilisés pour différencier DE en cellules progénitrices hépatiques. Au cours de la troisième étape, le HZM plus HGF, l’OSM et le sel de sodium de l’hydrocortisone 21-hemisuccinate ont été utilisés pour continuer à différencier les cellules progénitrice…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81870432 et 81570567 à X.L.Z.), (n° 81571994 à P.N.S.); the Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (No. 2020A1515010054 to P.N.S.), The Li Ka Shing Shantou University Foundation (No. L1111 2008 à P.N.S.). Nous tenons à remercier le professeur Stanley Lin du Shantou University Medical College pour ses conseils utiles.

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma M7522 For hepatic progenitor differentiation
488 labeled goat against mouse IgG ZSGB-BIO ZF-0512 For IF,second antibody
488 labeled goat against Rabbit IgG ZSGB-BIO ZF-0516 For IF,second antibody
Accutase Stem Cell Technologies 7920 For cell passage
Activin A peproTech 120-14E For definitive endoderm formation
Anti – Albumin (ALB) Sigma-Aldrich A6684 For IF and WB, primary antibody
Anti – Human Oct4 Abcam Ab19587 For IF, primary antibody
Anti – α-Fetoprotein (AFP) Sigma-Aldrich A8452 For IF and WB, primary antibody
Anti -SOX17 Abcam ab224637 For IF, primary antibody
Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) Sigma-Aldrich SAB1412164 For IF, primary antibody
B-27 Supplement Gibco 17504-044 For definitive endoderm formation
BSA Beyotime ST023-200g For cell blocking
CHIR99021 Sigma-Aldrich SML1046 For definitive endoderm formation
DAPI Beyotime C1006 For nuclear staining
DEPC-water Beyotime R0021 For RNA dissolution
DM3189 MCE HY-12071 For definitive endoderm formation
DMEM/F12 Gibco 11320-033 For cell culture
DMSO Sigma-Aldrich D5879 For hepatic progenitor differentiation
DPBS Gibco 14190-144 For cell culture
GlutaMAX Gibco 35050-061 For hepatic progenitor differentiation
H&E staining kit Beyotime C0105S For H&E staining
Hepatocyte growth factor (HGF) peproTech 100-39 For hepatocyte differentiation
HepatoZYME-SFM (HZM) Gibco 17705-021 For hepatocyte differentiation
Hydrocortisone-21-hemisuccinate Sigma-Aldrich H4881 For hepatocyte differentiation
Indocyanine Sangon Biotech A606326 For Indocyanine staining
Knock Out DMEM Gibco 10829-018 For hepatic progenitor differentiation
Knock Out SR Multi-Species Gibco A31815-02 For hepatic progenitor differentiation
Matrigel hESC-qualified Corning 354277 For cell culture
MEM NeAA Gibco 11140-050 For hepatic progenitor differentiation
mTesR 5X Supplement Stem Cell Technologies 85852 For cell culture
mTesR Basal Medium Stem Cell Technologies 85851 For cell culture
Oncostatin (OSM) peproTech 300-10 For hepatocyte differentiation
P450 – CYP3A4 (Luciferin – PFBE) Promega V8901 For CYP450 activity
PAS staining kit Solarbio G1281 For PAS staining
Pen/Strep Gibco 15140-122 For cell differentiation
Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG ZSGB-BIO ZB-2305 For WB,second antibody
Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot Beyotime P0256 For primary antibody dilution
ReverTraAce qPCR RT Kit TOYOBO FSQ-101 For cDNA Synthesis
RNAiso Plus TaKaRa 9109 For RNA Isolation
RPMI 1640 Gibco 11875093 For definitive endoderm formation
Skim milk Sangon Biotech A600669 For second antibody preparation
SYBR Green Master Mix Thermo Fisher Scientific A25742 For RT-PCR Analysis
Torin2 MCE HY-13002 For definitive endoderm formation
Tween Sigma-Aldrich WXBB7485V For washing buffer preparation

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Zhou, Q., Xie, X., Zhong, Z., Sun, P., Zhou, X. An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (171), e62654, doi:10.3791/62654 (2021).

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