Een efficiënte methode voor gerichte hepatocyt-achtige celinductie uit menselijke embryonale stamcellen
Summary
Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor differentiatie van menselijke embryonale stamcellen (hESC’s) in functionele hepatocyt-achtige cellen (HCC’s) door continu Activine A en CHIR99021 aan te vullen tijdens hESC-differentiatie tot definitief endoderm (DE).
Abstract
De potentiële functies van hepatocyt-achtige cellen (HLC’s) afkomstig van menselijke embryonale stamcellen (hESC’s) zijn veelbelovend voor ziektemodellering en geneesmiddelenscreeningtoepassingen. Hier wordt een efficiënte en reproduceerbare methode voor differentiatie van hESC’s in functionele HCC’s gegeven. De oprichting van een endoderm-afstamming is een belangrijke stap in de differentiatie naar HCC’s. Met onze methode reguleren we de belangrijkste signaleringsroutes door continu Activin A en CHIR99021 aan te vullen tijdens hESC-differentiatie tot definitief endoderm (DE), gevolgd door het genereren van hepatische voorlopercellen, en ten slotte HCC’s met typische hepatocytmorfologie in een stapsgewijze methode met volledig gedefinieerde reagentia. De hESC-afgeleide HCC’s die door deze methode worden geproduceerd, drukken stadiumspecifieke markers uit (waaronder albumine, HNF4α nucleaire receptor en natrium taurocholaat cotransporterend polypeptide (NTCP)), en vertonen speciale kenmerken met betrekking tot volwassen en functionele hepatocyten (waaronder indocyaninegroene kleuring, glycogeenopslag, hematoxyline-eosinekleuring en CYP3-activiteit), en kunnen een platform bieden voor de ontwikkeling van HLC-gebaseerde toepassingen in de studie van leverziekten.
Introduction
De lever is een zeer metabolisch orgaan dat verschillende rollen speelt, waaronder deoxidatie, opslag van glycogeen en afscheiding en synthese van eiwitten1. Verschillende pathogenen, geneesmiddelen en ertstrouw kunnen pathologische veranderingen in de lever veroorzaken en de functies ervan beïnvloeden2,3. Hepatocyten, als de belangrijkste functionele eenheid van de lever, spelen een belangrijke rol in kunstmatige leverondersteunende systemen en eliminatie van geneesmiddelentoxiciteit. De bron van primaire menselijke hepatocyten is echter beperkt in celgebaseerde therapie, evenals in onderzoek naar leverziekten. Daarom is het ontwikkelen van nieuwe bronnen van functionele menselijke hepatocyten een belangrijke onderzoeksrichting op het gebied van regeneratieve geneeskunde. Sinds 1998, toen hESC’s4werden vastgesteld, zijn hESC’s door onderzoekers op grote schaal overwogen vanwege hun superieure differentiatiepotentieel (ze kunnen differentiëren in verschillende weefsels in een geschikte omgeving) en hoge mate van zelfvernieuwbaarheid, en bieden zo ideale broncellen voor bioartificiële levers, hepatocyttransplantatie en zelfs leverweefseltechnologie5.
Momenteel kan de efficiëntie van de leverdifferentiatie sterk worden verhoogd door het endoderm te verrijken6. In de afstammingsdifferentiatie van stamcellen in endoderm zijn niveaus van de transformerende groeifactor β (TGF-β) signalerings- en WNT-signaleringsroutes de belangrijkste factoren in de knoop van de endodermvormingsfase. Activering van een hoog niveau van TGF-β en WNT-signalering kan de ontwikkeling van endoderm7,8bevorderen . Activine A is een cytokine behorend tot de TGF-β superfamilie. Daarom wordt Activine A veel gebruikt bij endoderm inductie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC’s) en hESC’s9,10. GSK3 is een serine-threonine eiwitkinase. Onderzoekers hebben ontdekt dat CHIR99021, een specifieke remmer van GSK3β, typische WNT-signalen kan stimuleren en stamceldifferentiatie onder bepaalde omstandigheden kan bevorderen, wat suggereert dat CHIR99021 potentieel heeft voor het induceren van stamceldifferentiatie in endoderm 11,12,13.
Hier rapporteren we een efficiënte en reproduceerbare methode om de differentiatie van hESC’s in functionele HCC’s effectief te induceren. De sequentiële toevoeging van Activin A en CHIR99021 produceerde ongeveer 89,7±0,8% SOX17 (DE marker)-positieve cellen. Na verder gerijpt te zijn in vitro, drukten deze cellen leverspecifieke markers uit en oefenden hepatocyt-achtige morfologie uit (gebaseerd op hematoxyline-eosinekleuring (H & E)) en functies, zoals opname van indocyaninegroen (ICG), glycogeenopslag en CYP3-activiteit. De resultaten tonen aan dat hESC’s met succes kunnen worden gedifferentieerd in volwassen functionele HLC’s door deze methode en een basis kunnen vormen voor leverziektegerelateerd onderzoek en in vitro geneesmiddelenscreening.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we een stapsgewijze methode die HCC’s uit hESC’s in drie fasen induceert. In de eerste fase werden Activin A en CHIR99021 gebruikt om hESC’s te differentiëren in DE. In de tweede fase werden KO-DMEM en DMSO gebruikt om DE te differentiëren in hepatische voorlopercellen. In de derde fase werden HZM plus HGF, OSM en hydrocortison 21-hemisuccinaatnatriumzout gebruikt om leverfappende voorlopercellen te blijven differentiëren in HCC’s.
Bij het gebruik van het protocol moet reke…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (No. 81870432 and 81570567 to X.L.Z.), (No. 81571994 to P.N.S.); de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong, China (nr. 2020A1515010054 aan P.N.S.), de Li Ka Shing Shantou University Foundation (nr. L1111 2008 aan P.N.S.). We willen prof. Stanley Lin van shantou University Medical College bedanken voor nuttig advies.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti – Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti – Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti – α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 – CYP3A4 (Luciferin – PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
Riferimenti
- Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
- Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
- Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity. Archives of Toxicology. , (2021).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763 (2019).
- Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
- Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
- Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
- Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
- Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. Biologia dello sviluppo. 449, 99-106 (2019).
- Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
- Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
- Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
- Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
- Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
- Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212 (2015).
- Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
- Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
- Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
- Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
- Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
- Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
- Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
- Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).
