Un metodo per preservare le radici delle zone umide e le rizosfere per l'imaging elementare

Le radici e le loro rizosfere sono dinamiche, eterogenee e di fondamentale importanza per capire come le piante ottengono nutrienti minerali e contaminanti^1,2,3. Le radici sono il percorso primario attraverso il quale i nutrienti (ad esempio, il fosforo) e i contaminanti (ad esempio, l’arsenico) si spostano dal suolo alle piante e quindi la comprensione di questo processo ha implicazioni per la quantità e la qualità del cibo, il funzionamento dell’ecosistema e il fitorisanimento. Tuttavia, le radici sono dinamiche nello spazio e nel tempo crescendo in risposta alle esigenze di acquisizione dei nutrienti e spesso variano per funzione, diametro e struttura (ad esempio, radici laterali, radici avventizie, peli di radice)². L’eterogeneità dei sistemi di radici può essere studiata su scale spaziali da cellulare a livello di ecosistema e su scale temporali da oraria a decadale. Pertanto, la natura dinamica ed eterogenea delle radici e del loro suolo circostante, o rizosfera, pone sfide per catturare la chimica della rizosfera nel tempo. Nonostante questa sfida, è imperativo studiare le radici nel loro ambiente del suolo per caratterizzare questa relazione critica pianta-suolo.

La chimica della rizosfera delle piante delle zone umide è particolarmente difficile da studiare a causa dei ripidi gradienti di ossigeno che esistono dal suolo sfuso alle radici, che cambiano nello spazio e nel tempo. Poiché le radici hanno bisogno di ossigeno per respirare, le piante delle zone umide si sono adattate alle condizioni di basso contenuto di ossigeno dei terreni delle zone umide creando aerenchima^4,5. Gli aerenchima sono tessuti corticali scavati che si estendono dai germogli alle radici, consentendo la diffusione dell’aria attraverso la pianta nelle radici. Tuttavia, parte di questa aria fuoriesce nella rizosfera in parti meno suberizzate delle radici, in particolare vicino alle giunzioni delle radici laterali, alle punte delle radici meno mature e alle zone di allungamento^6,7,8,9. Questa perdita radiale di ossigeno crea una zona ossidata nella rizosfera delle piante delle zone umide che influenza la chimica della rizosfera (bio-geo)ed è distinta dal suolo a massa ridotta^10,11,12. Per comprendere il destino e il trasporto di nutrienti e contaminanti nelle rizosfere e nelle radici delle zone umide, è fondamentale preservare il suolo sfuso chimicamente ridotto, la rizosfera ossidata e le radici delle piante delle zone umide per l’analisi. Tuttavia, poiché il terreno sfuso contiene costituenti del suolo ridotti che sono sensibili all’ossigeno, i metodi di conservazione delle radici e del suolo devono preservare le strutture delle radici e ridurre al minimo le reazioni sensibili all’ossigeno.

Esistono metodi per fissare i tessuti vegetali e preservare l’ultrastruttura per l’imaging, ma tali metodi non possono essere applicati per preservare chimicamente le radici che crescono nel suolo delle zone umide. Per le indagini in cui si desidera solo la distribuzione elementare all’interno delle cellule vegetali, le piante sono tipicamente coltivate idroponicamente e le radici possono essere facilmente rimosse dalla soluzione, fissate sotto congelamento ad alta pressione e sostituzione del congelamento e sezionate per una varietà di applicazioni di imaging tra cui spettrometria di massa ionica secondaria ad alta risoluzione (nanoSIMS), microscopia elettronica e analisi di fluorescenza a raggi X di sincrotrone (S-XRF)^{13, 14,15}. Per indagare la placca fe all’esterno delle radici delle zone umide, questi studi idroponici devono indurre artificialmente la formazione della placca Fe nella^{soluzione 16,}che non rappresenta accuratamente l’eterogeneità della distribuzione e della composizione minerale della formazione della placca Fe e degli elementi associati in situ^17,18,19,20. Esistono metodi per preservare il suolo delle zone umide e i microrganismi associati con il carotaggio²¹, ma è difficile ottenere radici con questa tecnica. I metodi attuali per visualizzare le radici che crescono nel suolo e la loro chimica rizosferica consistono in due tipi di misurazione primari: flussi elementari e concentrazione elementare totale (e speciazione). Il primo è tipicamente misurato utilizzando gradienti diffusivi in film sottili (DGT)^{22 , 23,24}, in cui il terreno viene posto in rizobox per sostenere la crescita delle piante in un ambiente di laboratorio e gli elementi labili nel terreno si diffondono attraverso un gel in uno strato legante. Questo livello di legame può quindi essere ripreso per quantificare gli elementi labili di interesse. Questa tecnica può illustrare con successo le relazioni tra le radici e la rizosfera^24,25,26,27, ma i manufatti del radicamento possono esistere coltivando piante in rizobox e le informazioni sull’interno della radice non vengono catturate con DGT. Quest’ultimo comporta il campionamento delle radici e della rizosfera, la conservazione del campione e l’analisi diretta della distribuzione elementare su una sezione campione. Per questo campionamento ambientale delle radici delle piante delle zone umide e della rizosfera circostante, è necessaria un’attenta gestione del campione per evitare artefatti dalla preparazione del campione.

Qui viene descritto un protocollo che preserva efficacemente le strutture delle radici e la chimica della rizosfera delle piante delle zone umide mediante slam-congelamento e liofilizzazione. Il congelamento flash può rallentare drasticamente le trasformazioni dei soluti sensibili all’ossigeno, ma può danneggiare le radici e può causare mobilizzazione quando i campioni si asciugano. Tuttavia, lo slam-freezing in cui il campione è congelato tra blocchi di rame pre-raffreddati con azoto liquido riduce al minimo il danno alle radici e la distorsione del campione²⁸. I campioni conservati vengono quindi incorporati in una resina epossidica che conserva as speciation^20,29 e possono essere tagliati e lucidati per l’imaging delle radici all’interno del loro terreno rizosfera. I campioni in questo rapporto sono stati analizzati mediante imaging di speciazione chimica S-XRF dopo un sezionamento sottile. Tuttavia, potrebbero essere utilizzate anche altre tecniche di imaging, tra cui la spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente da ablazione laser (LA-ICP-MS), l’emissione di raggi X indotta da particelle (PIXE), la spettrometria di massa ionica secondaria (SIMS) e la spettroscopia di rottura indotta da laser (LIBS).