Метод сохранения корней водно-болотных угодий и ризосфер для элементной визуализации

Корни и их ризосферы динамичны, неоднородны и критически важны для понимания того, как растения получают минеральные питательные вещества и загрязняющие вещества^1,2,3. Корни являются основным путем, по которому питательные вещества (например, фосфор) и загрязняющие вещества (например, мышьяк) перемещаются из почвы в растения, и, таким образом, понимание этого процесса имеет последствия для количества и качества пищи, функционирования экосистем и фиторемедиации. Тем не менее, корни динамичны в пространстве и времени, растущие в ответ на потребности в приобретении питательных веществ, и они часто различаются по функции, диаметру и структуре (например, боковые корни, адвентивные корни, корневые волоски)^2. Гетерогенность корневых систем может быть изучена в пространственных масштабах от клеточного до экосистемного уровня и во временных масштабах от ежечасного до десятилетнего. Таким образом, динамическая и гетерогенная природа корней и окружающей их почвы, или ризосферы, создает проблемы для захвата химии ризосферы с течением времени. Несмотря на эту проблему, крайне важно изучить корни в их почвенной среде, чтобы охарактеризовать эту критическую связь между растениями и почвой.

Химию ризосферы водно-болотных растений особенно сложно исследовать из-за крутых градиентов кислорода, которые существуют от объемной почвы до корней, которые изменяются в пространстве и времени. Поскольку корни нуждаются в кислороде для вдыхания, водно-болотные растения адаптировались к условиям низкого содержания кислорода в водно-болотных почвах, создав аэренхиму^4,5. Аэренхимы представляют собой полые корковые ткани, которые простираются от побегов до корней, позволяя диффузии воздуха через растение в корни. Однако часть этого воздуха просачивается в ризосферу в менее суберизированных частях корней, особенно вблизи боковых корневых соединений, менее зрелых кончиков корней и зон удлинения^6,7,8,9. Эта радиальная потеря кислорода создает окисленную зону в ризосфере водно-болотных растений, которая влияет на химию ризосферы (био-гео) и отличается от восстановленной объемной почвы^10,11,12. Чтобы понять судьбу и перенос питательных веществ и загрязняющих веществ в водно-болотных ризосферах и корнях, крайне важно сохранить химически восстановленную объемную почву, окисленную ризосферу и корни водно-болотных растений для анализа. Однако, поскольку объемная почва содержит восстановленные компоненты почвы, чувствительные к кислороду, методы сохранения корней и почвы должны сохранять корневые структуры и сводить к минимуму чувствительные к кислороду реакции.

Существуют методы фиксации растительных тканей и сохранения ультраструктуры для визуализации, но эти методы не могут быть применены для химического сохранения корней, растущих в водно-болотной почве. Для исследований, где желательно только элементарное распределение внутри растительных клеток, растения обычно выращиваются гидропонно, а корни могут быть легко извлечены из раствора, зафиксированы под высоким давлением замораживания и замораживания и разделены для различных приложений визуализации, включая масс-спектрометрию вторичных ионов высокого разрешения (nanoSIMS), электронную микроскопию и синхротронную рентгеновскую флуоресценцию (S-XRF) анализ^{13, 14,15}. Чтобы исследовать Fe-бляшки на внешней стороне водно-болотных корней, эти гидропонные исследования должны искусственно индуцировать образование Fe-бляшек в растворе^16,который не точно представляет неоднородность распределения и минерального состава образования Fe-бляшек и связанных с ними элементов in situ^17,18,19,20. Существуют методы сохранения водно-болотных угодий и связанных с ними микроорганизмов с замораживанием^21,но трудно получить корни с помощью этой техники. Современные методы визуализации корней, растущих в почве, и их химии ризосферы состоят из двух основных типов измерения: элементарных потоков и общей концентрации элементов (и видообразования). Первый обычно измеряют с использованием диффузных градиентов в тонких пленках (DGT)^22,23,24,в которых почва помещается в ризобоксы для поддержки роста растений в лабораторных условиях, а лабильные элементы в почве диффундирует через гель в связующий слой. Затем этот связующий слой может быть визуанирован для количественной оценки лабильных элементов, представляющих интерес. Этот метод может успешно проиллюстрировать отношения между корнями и ризосферой^24,25,26,27,но артефакты из корневой границы могут существовать при выращивании растений в ризобоксах, а информация о внутренней части корня не захватывается с помощью DGT. Последнее включает в себя отбор проб корней и ризосферы, сохранение образца и непосредственный анализ элементного распределения на участке образца. Для этого экологического отбора проб корней водно-болотных растений и окружающей их ризосферы требуется тщательная обработка образцов, чтобы избежать артефактов от подготовки образцов.

Здесь описан протокол, который эффективно сохраняет корневые структуры и химию ризосферы водно-болотных растений путем замораживания и сублимационной сушки. Мгновенное замораживание может резко замедлить превращение чувствительных к кислороду растворений, но может повредить корни и может вызвать мобилизацию, когда образцы высыхают. Однако захлопывание, когда образец заморожен между медными блоками, предварительно охлажденными жидким азотом, сводит к минимуму повреждение корней и искажение образца^28. Сохраненные образцы затем встраиваются в эпоксидную смолу, которая сохраняет as speciation^20,29 и может быть разрезана и отполирована для визуализации корней в их ризосферной почве. Образцы в этом отчете были проанализированы с помощью химического видообразования S-XRF после тонкого сечения. Тем не менее, также могут быть использованы другие методы визуализации, включая масс-спектрометрию плазмы с лазерной абляцией индуктивно связанной (LA-ICP-MS), рентгеновское излучение, индуцированное частицами (PIXE), масс-спектрометрию вторичных ионов (SIMS) и лазерную спектроскопию пробоя (LIBS).