이 문서에서는 아데노 관련 바이러스를 사용하여 대뇌 피질에서 분자 표적을 조작하고 전극 기록을 사용하여 깨어및 수면 중에이 조작의 효과를 모니터링하기위한 프로토콜을 설명합니다.
설치류에서 전기 코르티코그래피 (ECoG) 기록의 사용은 수면 연구와 광범위한 신경 학적 조건의 연구와 관련이 있습니다. Adeno 관련 바이러스 (AAV) 점점 뇌 회로와 그들의 기능의 이해를 개선 하기 위해 사용 됩니다. 특정 세포 인구 및/또는 정밀 분자 구성 요소의 AAV 매개 조작은 수면 손실의 부작용에 기여하는 새로운 수면 조절 회로/분자 및 주요 단백질을 식별하는 데 대단히 유용했습니다. 예를 들어, AAV를 이용한 필라멘트 액틴 절제 단백질 코필린의 활동을 억제하면 수면 부족유발 기억 장애를 방지할 수 있습니다. 여기서, 피질 코필린이 깨어및 수면 ECoG 신호를 조절하는지 여부를 검사하기 위해 뇌 피질 영역에서 코필린 기능의 조작을 ECoG 활동의 기록과 결합하는 프로토콜이 기재된다. AAV 주사는 성인 남성 및 여성 마우스에서 ECoG 및 전극 (EMG) 전극의 이식과 동일한 수술 시 수행된다. 마우스는 마취되고, 그들의 머리는 면도됩니다. 피부 세척 및 절개 후, 모터 피질의 스테레오탁스 좌표가 결정되고, 두개골은 이 위치에서 관통된다. 코필린의 비활성 형태인 코필린S3D를표현하는 AAV로 미리 채워진 캐뉼러가 피질 조직에 천천히 배치된다. AAV 주입 후, 금으로 덮인 나사(ECoG 전극)는 두개골을 통해 나사로 고정되어 목 근육(EMG 전극)에 삽입된 금 전선으로 두개골에 시멘트됩니다. 동물은 복구하고 코필린S3D의충분한 표현을 보장하기 위해 3 주가 허용됩니다. 감염된 영역 및 세포 유형은 면역 히스트토화학을 사용하여 검증되며, ECoG는 경계 상태 및 스펙트럼 분석의 시각적 식별을 사용하여 분석됩니다. 요약하자면, 이 결합된 방법론적 접근법은 깨어와 수면 중에 동기화된 대뇌 피질 활동의 조절에 대한 신경 형태 및 연결을 조절하는 분자 성분의 정확한 기여에 대한 조사를 가능하게 합니다.
뇌전도 (또는 일반적으로 설치류의 전기 신경학 [ECoG]와 전기 (EMG) 기록은 신경 과학, 신경학 및 정신과에서 수면 연구뿐만 아니라 더 광범위하게 사용됩니다. 조합에서, 이러한 전기생리학적 신호는 인간과 설치류1,2,3,4모두에서 경계 상태와 상태 지속 시간 및 스펙트럼 조성물의 후속 정량화를 허용한다. 이러한 정량화는 신경퇴행성 질환 및 모델5,6,7 또는 유전자 변형8,9와같은 병리학적 조건에서 수면이 어떻게 변형되는지 이해하는 데 유용하다. 예를 들어, 신경 통신에 연결된 상이한 유전자의 녹아웃(KO)은 마우스와 과일 플라이10,11,12,13모두에서 절전 및 수면의 지속 시간을 변화시키는 것으로 나타났다. 설치류에서 전신 KO의 연구에서 발생하는 잠재적 인 발달 보상을 해결하고 유전자 조작의 미세한 제어를 허용하기 위해, 유전자 발현을 조작하는 효율적인 방법은 아데노 관련 바이러스 (AAV)를 사용하는 것입니다. AAV 매개 유전자 조작은 주어진 분자 표적을 다운 또는 상향 조절하고 다양한 유형의발기인(14)을사용하여 특정 세포 집단으로 조작을 제한하는 데 사용될 수 있다. AAV는 또한 정기적으로 클러스터된 짧은 palindromic 반복(CRISPR)/Cas9기술(15,16)에서전달 방법으로 광범위하게 사용된다. 이러한 방법론은 일반적으로 면역 형광을 사용하여 감염된 영역의 정량화를 허용하는 기자의 발현과 관련된 유전 조작의 더 나은 시간적 및 공간 제어를 허용합니다.
AAV는 또한 광유전학 및 화학유전학을 통한 뉴런 활성의 세포 유형 특이적 조작을 위한 주요 벡터를 나타내며,17,18,19,신경퇴행성 질환, 행동, 인식 및 수면20, 21,22에대한 최근 연구에서 널리 사용되고 있다. 수면 연구에서, 기저 전뇌, 시상하부 및 sublaterodorsal tegmentum과 같은 특정 뇌 영역의 활성화 또는 억제를 위한 광유전학의 적용은 각성, 느린 파도 수면(비급속 눈 운동 수면, 역설적 수면, 자궁 마비,자궁 마비로 알려져 있음)및 catpla의 제어에서 자신의 역할을 결정하는 데 유용했습니다. 24,25. 더욱이, AAV 중재 조작은 중요한 수면 조절 회로 및 수면 손실의 부작용에 기여하는 분자를 해명하는 데 도움이되었다 26,27,28. 예를 들어, 수면 부족 유발 기억 장애에 연루된 것으로 나타난 단백질 1가지는 코필린29,30이다. 본 단백질은 액틴에 물리적으로 결합하여 액틴 필라멘트의 재구성에 참여하는 필라멘트 액틴 분리 단백질로, 필라멘트의 분해를 역동적인 방식으로촉진한다(31). AAV 매개 접근법을 이용한 코필린 활성억제는마우스(29)의수면 부족으로 유도된 시냅스 가소성 및 기억력 결핍뿐만 아니라 척추 손실을 방지하는 것으로 나타났다. 종합적으로, 이 연구 결과는 설치류에 있는 잠 부족의 결과 및 잠 부족의 결과를 이해하기 위하여 AAV 중재한 조작의 유용성과 관련성을 강조합니다.
여기서, AAV를 이용한 야생형(WT) 마우스의 대뇌 피질 영역에서 코필린 기능의 조작과 함께 ECoG 및 EMG 전극 이식 및 레코딩을 결합하는 프로토콜이 기재되어 있다. 보다 정밀하게, 마우스 코필린(cofilinS3D)의인광형태의 코딩 서열을 발현하는 AAV(혈청형 9)는 비활성32,33을렌더링하고, 모터 피질(M1 및 M2)에 주입된다. ECoG 전극은 감염된 세포의 동기화된 피질 활성의 기록을 보장하기 위해 사출 부위에 직접 이식된다. ECoG/EMG 기록은 수술 후 3주 후에 방해받지 않는 조건하에서 24시간 동안 진행되어 회복, 적응 및 높은 코필린 S3D 발현을허용한다. 기록은 그 때 경계 상태 및 ECoG 스펙트럼 분석의 식별을 위해 사용됩니다, 이전 연구에 설명된 바와 같이11,34. 이 방법론은 특히 피질 코필린이 마우스의 깨어 및 수면 ECoG 신호를 조절하는 방법을 구체적으로 밝힐 수 있습니다. 전기 생리적 기록과 AAV 매개 유전자 조작의 이 조합은 특정 두뇌 기능에 있는 각종 분자 요소의 역할을 조사하기 위하여 특히 관련되고 WT와 남녀 및 그밖 종의 유전으로 변형된 마우스에 대한 관심의 피질 (및 subcortical) 두뇌 지역에 적용될 수 있었습니다.
이 프로토콜은 AAV를 사용하여 분자 표적을 조작하는 동안 ECoG 및 EMG 활동을 모니터링하는 정확하고 간단한 방법을 설명합니다. 적절한 그룹 간 비교를 위해, 항상 테스트 및 제어 동물을 위해 같은 날에 외과 적 수술 (AAV 주사 및 전극 이식)을 계획하고, 동시에 자신의 전기 생리학적 신호를 기록하는 것이 좋습니다. 시험과 대조군 동물 들 사이 유사한 바이러스 성 발현을 얻기 위하여는, 동일한 바이러스 성 티터를 주입하는 것이 바람직하다. 본 인하여, 대조군 AAV의 바이러스 성 티터는 유사한 바이러스 성 발현을 보장하기 위해 테스트 AAV의 절반으로 감소하였다. 실험자는 뇌 영역 /피질 층 타겟팅에서 동물 간 가변성을 낮게 보장하기 위해 스테레오 탁스 좌표의 측정에 매우 주의해야합니다. 또한, 사출 깊이가 두개골 표면에서 계산되고, 두개골 두께가 연령과 성별에 따라 달라진다는 점을 감안할 때, 캐뉼라의 배치는 항상 포스트 프로토콜 조직학 또는 면역 작용(예: 그림 2)을사용하여 검증되어야 하며, 필요한 경우 스테레오탁좌표를 조정해야 한다. 40분 AAV 주입 전반에 걸쳐, 펌프 막힘과 같은 잠재적인 문제를 신속하게 감지하고 수정하기 위해 사출 속도를 모니터링하는 것이 매우 중요합니다. 몇몇 실험단계는 또한 최적 전기 생리신호를 얻기 위하여 중요합니다. 예를 들어, 전극 이식 중에 지나치게 나사를 조이지 마십시오. 나사는 대뇌 피질의 손상과 신경교 흉터의 형성을 최소화하기 위해 적어도 2.5mm의 두개골에서 튀어 나와야합니다. 그 후, i) 전극의 사지에 시멘트를 적용하는 것을 피하는 것도 대단히 중요하며, ii) 커넥터에 전극의 신속한 납땜을 보장하고, iii) 전극 사이에 접촉이 없는지 확인한다.
ECoG 및 EMG 레코딩을 위해 여기에 제시된 절차는 매우 잘 확립되어 간단하며 마우스2,11,13,34에서절전 및 수면을 모니터링하는 데 널리 사용됩니다. 연속 ECoG 및 EMG 기록은 며칠 연속(및 주)에 걸쳐 수행될 수 있으며, 각성 및 수면 량 및 건축2,11,12(예를 들어, 빛 및 암흑 기간당 다른 상태에서 소요되는 시간, 각 상태의 에피소드 수, 각 상태의 여러 주에서 소요되는 시간, 각 상태의 에피소드 수와 관련된 변수를 포함하는 여러 줄의 분석을 수행하는 데 사용할 수 있는 매우 풍부한 데이터 집합을 생성할 수 있습니다. 수면의 24-h 분포), 절전 및 수면 스펙트럼 함량34,41 (예를 들어, 다른 주파수 대역에서의 전력 [그림 3],스케일 프리 활동)과 개별파도42,43,44 (예 : 느린 파 진폭 및 경사)의 특성. AAV 매개 분자 조작과 함께 사용하면 형질 전환 동물에서 발생할 수있는 잠재적 인 발달 보상을 피하는 것이 추가적인 이점이 있습니다. 연습으로, 전체 절차, 40 분 AAV 주입을 포함 하 여, 약 90 분에서 수행 될 수 있다. 수술이 최소 침습이기 때문에 사망률은 (매우) 낮아야합니다.
ECoG/EMG 레코딩 및 AAV의 표적 조작의 동시 사용은 다양한 다른 장점과 응용 프로그램을 제공합니다. 예를 들어, 적당히 수행될 때 스테레오탁틱 타겟팅의 정밀도는 매우 높고 복제성이 높으며 수면 또는 기타 생리적 과정의 조절에서 주어진 뇌 영역(및/또는 지역 내의 세포 유형 또는 분자 원소)의 특정 역할을 결정하는 데 유용합니다. 따라서 여러 가지 피질 영역은 현재 프로토콜의 적응을 사용하여 쉽게 표적으로 삼을 수 있습니다. 또한, AAV를 사용한 표적 조작은 ECoG 기록 사이트와 다른 피질/하위 영역으로 지시될 수 있습니다. 이러한 경우, AAV 주입을 위한 버 구멍은 치과 시멘트(또는 뼈 왁스)를 사용하여 고정된 작은 유리 덮개 슬립으로 덮을 수 있었다. 강화된 특이성을 위해, AAV 구조는 종종 정밀한 세포유형(14)의표적 감염을 허용하는 프로모터를 포함한다. CamKIIα 프로모터는 현재 프로토콜에서 전동 피질의 흥분 피라미드세포(14,29,45)를구체적으로 표적으로 삼는 데 사용하였다. 이러한 전략은 코필린(cofilinS3D사용)32,33의 운동 피질의 흥분성 뉴런및 ECoG 활성의 상태별 변화관찰(도 3)의불활성화를 가능하게 하였다. 감염/트랜스포션 효능을 평가하기 위해 향후 프로토콜 사용자는 제시된 AAV-ECoG 프로토콜을 면역형광에 의한 공동 염색 중 하나와 결합하고, 높은 배율 이미지를 사용하여 대상의 단일 라벨링을 보여주는 총 세포 수중에서 이중 라벨링을 나타내는 세포의 수를 계산할 수 있습니다(여기, CaMKIiα-expressing 뉴런). 최근 연구에서는, 여기에 설명된 것과 유사한 AAV-ECoG 방법은 시냅신 프로모터를 함유하는 AAV를 사용하여 모터 피질의 모든 뉴런에서 연약한 X 정신 지체 증후군 관련 단백질 1(FXR1)을 과발현하는 데 사용되었으며, 경계 상태 분포 및 스펙트럼 함량28에대한 이러한 조작의 효과를 밝혔다. 이 사실 인정은 AAV를 사용하여 표적 두뇌 지구에 있는 주어진 분자를 조작하는 것이 특정 깨어/수면 매개 변수의 규칙에 있는 역할을 드러낼 수 있는 방법을 보여줍니다.
기술된 프로토콜의 제한은 AAV 주입을 수행하기 전에 캐뉼라 배치로 발생하는 뇌 조직의 작은 병변이며, 이는 염증 반응을 동반할 수도 있다. 이것은 피질 영역에서 AAV 주입을 수행 할 때 특히 우려될 수 있으며 항상 적절한 제어를 사용하여 다루어야합니다. 대안적으로, 현재 프로토콜은 반응성 글리오시스 및/또는 미세글리아 활성화(예를 들어, 면역형광을 사용하여)의 정량화로 뒤따를 수 있어 제어 및 테스트 그룹에서 유사한 수준을 보장하고 따라서 ECoG 판독기에 있을 수 있다. 두 번째 제한은 전극과 커넥터 사이의 나쁜 연결의 위험에 관한 것으로, 이는 연속또는 때때로 나쁜 전기 생리학적 신호가 발생할 수 있습니다. 단단히 나사, 납땜 및 시멘트 전극이 문제의 발생률을 최소화합니다. 세 번째 제한은 동물들이 기록 중에 머리 몽타주를 통해 테더링되는 것과 관련이 있으며, 이는 적어도 어느 정도는 운동 및 기타 행동을 제한할 수 있으며 때로는 케이블 손상 및 신호 손실을 초래할 수 있습니다. 마지막으로, 제시된 프로토콜은성인마우스에 더 적합하며, 젊은 동물의 두개골 크기가 이전에 설명된 바와 같이 묘사된 머리 몽타주를 설치하는 데 어려움을 일으킬 수 있음을 감안할 때.
정확한 표적의 결합된 ECoG/EMG 기록 및 AAV 매개 조작은 또한 수면의 신경과학 이외에 연구 분야에도 적용됩니다. 그 중에서도 발작의 동물 모델에서 간질 사건을 연구하고 조작하는 데 사용될 수 있으며 메모리 인코딩 및 통합에 관련된 뇌 진동을 조절하는 강력한도구입니다(46,47). 따라서, 잠재적인 응용 프로그램은 확실히 정신 의학 및 신경학에 있는 근본적인 연구 필드를 포괄합니다, 신경 퇴행성 질병을 포함하여. 분자의 비활성 형태를 발현하는 능력 외에도, AAV는 과발현 또는 다운조절(예를 들어, 소간섭 RNA, CRISPR/Cas9) 또는 전신 KO에서 분자의 발현을 구출하는 데 사용될 수 있고 사용되었다. 중요한 것은, 현재 프로토콜의 이중 방법론은 수면과 신경변성48,49를모두 이해하는 흥미로운 모델을 나타내는 쥐 및 주신경 설치류와 같은 다른 포유류 종에도 적용가능하다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 수면 분자 생리학의 캐나다 연구 위원장에 의해 지원되었습니다. 저자는 기술적인 도움을 청한 끌로에 프로보스트와 캐롤라인 부차드에게 감사한다.
Surgery peparation | |||
21 G needle | Terumo | NN-2125R | |
6-channel connector | ENA AG | BPHF2-O6S-E-3.2 | Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below |
Distrelec | 300-93-672 | Potential replacement for discontinued connector above | |
C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | 000664 | B6 | Animals bred on site |
Pluronic F-68 | Non-ionic surfactant | ||
Gold wire 0.2 mm diameter | Delta scientific | 920-862-41 | Non-insulated |
Hamilton syringe (10 μL) | Fisher Scientific | 14815279 | |
Infusion syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
Injection cannula 28 G | Plastics one | C313l-SPCL | |
Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
Ketamine (10 mg/mL) | SANDOZ | 4550 | |
Lead-free solder | AIM | SN100C | |
Lubricating ophthalmic ointment | ALLERGAN | 210889 | |
PE 50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
Flat fillister head self tapping screws | MORRIS | FF00CE125 | ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length |
Soldering iron | Weller | WES51 | |
Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
Trimmer | Harvard Apparatus | 72-9063 | |
Xylazine (20 mg/mL) | Bayer | 2169592 | |
Intracortical AAV injection with syringe pump | |||
0.7 mm drill bit | Dremel | 628 | |
AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA | UPenn Viral Core | ||
AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP | UPenn Viral Core | ||
Cotton tippped applicators | Medicom | 806 | |
Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
Extra-fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Stereotaxic arm | Stoelting | 51604U | |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
Surgical clamps | Fine science tools | 18050-28 | |
Tissue scissor | Magna Stainless | M4-124 | |
ECoG/EMG electrode implantation | |||
Buprenorphine (0.3 mg/mL) | CEVA | 57133-02 | |
Curved forceps | Fine science tools | 11001-12 | |
Delicate task wipers | Kimtech | 34120 | |
Dental acrylic cement | Yates Motloid | 44115 | |
Dumont #5 forceps | Fine science tools | 91150-20 | |
Extra fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Kelly forceps | Fine science tools | 13002-10 | |
Liquid acrylic | Yates Motloid | 44119 | |
Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting | Ethicon | MCP494 | |
Providone-iodine 10% | Triad disposables | 10-8208 | |
RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2 | 3M | 56849 | |
Immunofluorescence and ECoG recording | |||
36-Channel EEG Wearable Headbox | LaMONT Medical | 832-000350 | |
CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2) | Invitrogen | 13-7300 | Dilution 1:500 |
Conductors Awg PVC Insulation Cable | Calmont Wire & Cables | HC-0819075R0 | |
Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilution 1:1000 |
Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Dilution 1:500 |
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb | Cell signaling | 3724 | Dilution 1:800 |
Programmable Amplifier | LaMONT Medical | 815-000002-S2 | |
Stellate Harmonie | Natus | HSYS-REC-LT2 | |
Swivel connector | Crist Instrument Company Inc. | 4-TBC-9-S |