本稿では、アデノ関連ウイルスを用いた大脳皮質の分子標的の操作と、電気コルチコチコの記録を用いた覚醒および睡眠中のこの操作の影響をモニタリングするためのプロトコルについて説明する。
げっ歯類の電気コルチコグラフィー(ECoG)録音の使用は、睡眠研究と神経学的状態の広い範囲の研究に関連しています。アデノ関連ウイルス(AAV)は、脳回路とその機能の理解を深めるためにますます使用されています。特定の細胞集団や正確な分子成分のAAV媒介操作は、睡眠喪失の悪影響に寄与する新しい睡眠調節回路/分子および主要タンパク質を同定するのに非常に有用であった。例えば、AAVを用いた糸状アクチン切断タンパク質コフィリンの阻害活性は、睡眠不足誘発記憶障害を防止する。ここで、大脳皮質領域におけるコフィリン機能の操作とECoG活性の記録を組み合わせて、皮質コフィリンが覚醒および睡眠ECoG信号を調節するかどうかを調べるプロトコルが記載されている。AAV注射は、成人の雄マウスおよび雌マウスにおけるECoGおよび筋電図(EMG)電極の注入と同じ外科的処置の間に行われる。マウスは麻酔を受け、頭は剃ります。皮膚洗浄および切開後、運動皮質の立体的座標が決定され、頭蓋骨はこの場所に突き刺さる。コフィリンの非活性形態であるコフィリンS3Dを発現するAAVを事前に充填したカニューレは、皮質組織にゆっくりと配置される。AAV注入後、金で覆われたネジ(ECoG電極)は頭蓋骨を通してねじ込まれ、首の筋肉に挿入された金線(EMG電極)で頭蓋骨に固定されます。動物は回復し、コフィリンS3Dの十分な発現を確保するために3週間を許可されています。感染領域と細胞型は免疫学化学を用いて検証され、ECoGは警戒状態の視覚的同定とスペクトル解析を用いて分析される。要約すると、この結合された方法論的アプローチは、覚醒と睡眠中の同期大脳皮質活動の調節に対する神経形態および結合性を調節する分子成分の正確な寄与の調査を可能にする。
脳波(または一般的にげっ歯類の電気コルチコグラフィー[ECoG])および電気的研究(EMG)の記録は、睡眠研究だけでなく、神経科学、神経学、精神医学においてより広く使用されています。組み合わせて、これらの電気生理学的シグナルは、警戒状態の同定と、その後の状態持続時間およびスペクトル組成の定量化を、ヒトおよびげっ歯類1、2、3、4の両方で可能にする。このような定量化は、神経変性疾患やモデル5、6、7などの病理学的状態において睡眠がどのように修飾されているかを理解するのに有用であった。例えば、神経伝達に関連する異なる遺伝子のノックアウト(KO)は、マウスとフルーツフライ10、11、12、13の両方で覚醒および睡眠の持続時間を変化することが示された。げっ歯類の全身KOの研究から生じる潜在的な発達補償に取り組み、遺伝子操作のより細かい制御を可能にするために、遺伝子発現を操作する効率的な方法は、アデノ関連ウイルス(AAV)を使用することです。AAV媒介性遺伝子操作は、特定の分子標的をダウンまたはアップレキュアに使用し、異なるタイプのプロモーター14を使用して特定の細胞集団に対する操作を制限することができる。AAVは、クラスター化された定期的に間隔を空けた短いパリンドローム反復(CRISPR)/Cas9技術15,16の配信方法としても広く使用されている。これらの方法論は、一般的に免疫蛍光を使用して感染領域の定量を許可するレポーターの発現に関連付けられている遺伝子操作のより良い時間的および空間的制御を可能にする。
AAVはまた、光遺伝学および化学遺伝学を介した神経活動の細胞型特異的操作の主なベクターを表す17,18,19,神経変性疾患に関する最近の研究で広く使用されている, 行動, 認知, 睡眠20,21,22.睡眠研究では、基底前脳、視床下部、および亜側面性テグメンタムなどの特定の脳領域の活性化または阻害のための光遺伝学の適用は、覚醒、遅波睡眠(非急速眼球運動睡眠とも呼ばれる)、逆説的な睡眠(または眼球運動睡眠)、およびカタプレックスの制御における彼らの役割を決定するのに有用であった。 24、25。さらに、AAV媒介操作は、睡眠喪失26、27、28の悪影響に寄与する重要な睡眠調節回路および分子を解明するのに役立った。例えば、睡眠不足による記憶障害に関与することが示されている1つのタンパク質は、コフィリン29,30である。このタンパク質は、アクチンに物理的に結合し、かつ動的にフィラメントの分解を促進することによってアクチンフィラメントの再編成に関与する糸状のアクチン断裂タンパク質である31。AAV媒介型アプローチを用いたコフィリン活性の阻害は、マウス29における睡眠不足によって誘発されるシナプス可塑性および記憶障害と同様に脊椎喪失を防ぐことが示された。総称して、これらの研究は、睡眠調節とげっ歯類の睡眠不足の結果を理解するためのAAV媒介操作の有用性と関連性を強調する。
ここで、AAVを用いた野生型(WT)マウスの大脳皮質領域におけるコフィリン機能の操作とECoGおよびEMG電極注入および記録を組み合わせたプロトコルについて説明する。より正確には、マウスコフィリンのホスホミメティック形態の符号化配列を発現するAAV(血清型9)(コフィリンS3D)を、非活性32、33にレンダリングし、運動皮質(M1およびM2)に注入される。ECoG電極は、感染細胞の同期皮質活性の記録を確実にするために、注射部位に直接埋め込まれる。ECoG/EMGの記録は回復、適応および高コフィリンS3Dの表現を可能にするために外科の3週間後に乱れない条件下で24時間行われる。記録は、以前の研究11、34で説明したように、警戒状態とECoGスペクトル分析の識別に使用されます。この方法論は、皮質コフィリンがマウスの覚醒および睡眠ECoG信号をどのように調節するかを具体的に明らかにすることができる。この電気生理学的記録とAAV媒介遺伝子操作の組み合わせは、特定の脳機能における様々な分子元素の役割を調査するのに特に関連しており、WTおよび男女および他の種の遺伝子組み換えマウスに関心のある皮質(および皮質下)脳領域に適用することができる。
このプロトコルは、AAVを使用した分子標的の操作中にECoGおよびEMG活性を監視する正確かつ簡単な方法を記述する。グループ間の適切な比較のために、テストとコントロール動物のために同じ日に常に外科的処置(AAV注入および電極注入)を計画し、同時にそれらの電気生理学的信号を記録することを強く推奨する。試験動物と対照動物との間で同様のウイルス発現を得るためには、同じウイルス用タイターを注入することが望ましい。本例では、コントロールAAVのウイルス・チターは、類似のウイルス発現を確保するために試験AAVの半分に減少していた。実験者は、脳領域/皮質層ターゲティングにおける動物間変動性が低いように、立体的座標の測定に非常に注意する必要があります。さらに、射出深度が頭蓋骨表面から計算され、頭蓋骨の厚さが年齢や性別によって変化することを考えると、カニューレの配置は、プロトコル後の神学または免疫体化学(例えば、 図2)を使用して常に検証し、適切な位置/深度の注入を確実にし、必要に応じて立体座標を調整する必要があります。40分AAV注入を通して、ポンプ閉塞などの潜在的な問題を迅速に検出し、修正するために注入速度を監視することは非常に重要です。いくつかの実験ステップは、最適な電気生理学的信号を得るためにも重要です。例えば、電極注入の間にねじを締めないでください。大脳皮質の損傷や、グリア瘢痕の形成を最小限に抑えるために、ネジは頭蓋骨から少なくとも2.5mmで突き出す必要があります。その後、i)電極の先端にセメントを塗布することを避け、ii)電極をコネクタに迅速にはんだ付けし、iii)電極間に接触がないことを確認することも非常に重要です。
ECoGおよびEMGの記録のためにここに提示されるプロシージャは非常によく確立され、簡単で、マウス2、11、13、34の覚醒および睡眠を監視するために広く使用される。連続ECoGとEMGの録音は、連続した数日間(および数週間)実行することができ、覚醒と睡眠量とアーキテクチャ2、11、12(例えば、光と暗い期間ごとに異なる状態で過ごした時間、各状態のエピソードの数)に関連する変数を含む分析のいくつかの行を実行するために使用することができる非常に豊富なデータセットを生成することができます 睡眠の24時間分布)、覚醒および睡眠スペクトル含有量34、41(例えば、異なる周波数帯のパワー[図3]に似た、スケールフリー活性)、および個々の波の特性42、43、44(例えば、遅波振幅および傾斜)。AAV媒介分子操作と組み合わせて使用する場合、トランスジェニック動物で起こり得る潜在的な発達補償の回避が追加の利点である。練習では、40分AAV注入を含む全ての手順は、約90分で行うことができる。手術は低侵襲であるため、死亡率は(非常に)低くする必要があります。
AAVによるECoG/EMG記録とターゲット操作の同時使用は、他にもさまざまな利点と用途を提供します。例えば、立体的ターゲティングの精度は、適切に行われると、非常に高く、複製可能であり、睡眠または他の生理学的プロセスの調節における特定の脳領域(および/または細胞タイプまたは領域内の分子要素)の特定の役割を決定するのに有用である。したがって、いくつかの異なる皮質領域は、現在のプロトコルの適応を使用して容易に標的化することができる。さらに、AAVを用いた標的操作は、ECoG記録部位とは異なる皮質/皮質下領域に向けられる可能性がある。このような場合、AAV注入のためのバリ穴は、歯科用セメント(または骨ワックス)を使用して固定された小さなガラスカバースリップで覆われることができた。特異性を高めるため、AAV構築には、多くの場合、正確な細胞タイプ14の標的感染を可能にするプロモーターが含まれている。CamKIIαプロモーターは、運動皮質の興奮性錐体細胞14、29、45を特異的に標的化するために本プロトコルで使用された。この戦略は、コフィリンの不活性化(コフィリンS3Dを使用)32、33の運動皮質の興奮性ニューロンにおける、およびECoG活性における状態特異的変化の観察を可能にした(図3)。感染/伝達効果を評価するために、将来のプロトコルユーザーは、提示されたAAV-ECoGプロトコルと免疫蛍光による共染色の1つを組み合わせ、高倍率画像を使用して、標的の単一標識を示す細胞の総数のうち二重標識を示す細胞の数を計算することができます(ここでは、CaMKIIα発現ニューロン)。最近の研究では、ここで説明したものと同様のAAV-ECoG法を用いて、シナプシンプロモーターを含むAAVを用いて運動皮質のすべてのニューロンにおいて脆弱X精神遅滞症候群関連タンパク質1(FXR1)を過剰発現させ、この操作が警戒状態分布およびスペクトル含有量28に及ぼす影響を明らかにした。これらの知見は、AAVを使用して標的脳領域内の特定の分子を操作することによって、特定の覚醒/睡眠パラメータの調節における役割を明らかにする方法を示している。
記載されたプロトコルの制限は、AAV注射を行う前にカニューレ配置で起こる脳組織の小さな病変であり、これはまた、炎症反応を伴うことがある。これは、皮質下領域で AAV 注入を実行する場合に特に懸念される可能性があり、適切な制御を使用して常に取り組む必要があります。.あるいは、現在のプロトコルは、リアクティブなグリオシスおよび/または微小グリア活性化(例えば、免疫蛍光を使用して)の定量化を行い、制御および試験群で同様のレベルを確保し、したがってECoG読み出しでそれに続く可能性がある。第2の制限は、電極とコネクタの間の接続不良のリスクに関連し、連続的または時折悪い電気生理学的信号をもたらす可能性があります。しっかりとねじ込み、はんだ付け、およびセメント電極は、この問題の発生を最小限に抑えます。第3の制限は、記録中にヘッドモンタージュを介してつながれる動物に関連しており、少なくともある程度移動やその他の行動を制限し、時にはケーブルの損傷と信号損失を引き起こし得る。最後に、提示されたプロトコルは、若い動物の頭蓋骨の大きさが、前述の2のように、描かれた頭部モンタージュの設置に困難を引き起こす可能性があることを考えると、成体マウスに適している。
ECoG/EMGの記録とAAV媒介的な正確な標的の操作を組み合わせることは、睡眠の神経科学以外の研究分野にも適用可能である。とりわけ、発作の動物モデルにおけるてんかん事象の研究および操作に使用することができ、記憶符号化および統合46、47に関与する脳振動を調節するための強力なツールである。したがって、潜在的な応用は確かに神経変性疾患を含む精神医学と神経学の基礎研究の分野を包含する。AAVは、非活性な分子の発現能力に加えて、過剰発現または下方調節(例えば、小干渉RNA、CRISPR/Cas9)、または全身KO中の分子の発現を救うために使用され、使用されています。重要なことに、現在のプロトコルの二重方法論は、睡眠と神経変性48、49の両方を理解する興味深いモデルを表すラットおよび日経げっ歯類のような他の哺乳類種にも適用可能である。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、睡眠分子生理学のカナダ研究委員長によって資金提供されました。著者たちは、クロエ・プロボストとキャロライン・ブシャールに技術的な助けを求めて感謝しています。
Surgery peparation | |||
21 G needle | Terumo | NN-2125R | |
6-channel connector | ENA AG | BPHF2-O6S-E-3.2 | Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below |
Distrelec | 300-93-672 | Potential replacement for discontinued connector above | |
C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | 000664 | B6 | Animals bred on site |
Pluronic F-68 | Non-ionic surfactant | ||
Gold wire 0.2 mm diameter | Delta scientific | 920-862-41 | Non-insulated |
Hamilton syringe (10 μL) | Fisher Scientific | 14815279 | |
Infusion syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
Injection cannula 28 G | Plastics one | C313l-SPCL | |
Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
Ketamine (10 mg/mL) | SANDOZ | 4550 | |
Lead-free solder | AIM | SN100C | |
Lubricating ophthalmic ointment | ALLERGAN | 210889 | |
PE 50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
Flat fillister head self tapping screws | MORRIS | FF00CE125 | ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length |
Soldering iron | Weller | WES51 | |
Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
Trimmer | Harvard Apparatus | 72-9063 | |
Xylazine (20 mg/mL) | Bayer | 2169592 | |
Intracortical AAV injection with syringe pump | |||
0.7 mm drill bit | Dremel | 628 | |
AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA | UPenn Viral Core | ||
AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP | UPenn Viral Core | ||
Cotton tippped applicators | Medicom | 806 | |
Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
Extra-fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Stereotaxic arm | Stoelting | 51604U | |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
Surgical clamps | Fine science tools | 18050-28 | |
Tissue scissor | Magna Stainless | M4-124 | |
ECoG/EMG electrode implantation | |||
Buprenorphine (0.3 mg/mL) | CEVA | 57133-02 | |
Curved forceps | Fine science tools | 11001-12 | |
Delicate task wipers | Kimtech | 34120 | |
Dental acrylic cement | Yates Motloid | 44115 | |
Dumont #5 forceps | Fine science tools | 91150-20 | |
Extra fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Kelly forceps | Fine science tools | 13002-10 | |
Liquid acrylic | Yates Motloid | 44119 | |
Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting | Ethicon | MCP494 | |
Providone-iodine 10% | Triad disposables | 10-8208 | |
RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2 | 3M | 56849 | |
Immunofluorescence and ECoG recording | |||
36-Channel EEG Wearable Headbox | LaMONT Medical | 832-000350 | |
CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2) | Invitrogen | 13-7300 | Dilution 1:500 |
Conductors Awg PVC Insulation Cable | Calmont Wire & Cables | HC-0819075R0 | |
Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilution 1:1000 |
Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Dilution 1:500 |
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb | Cell signaling | 3724 | Dilution 1:800 |
Programmable Amplifier | LaMONT Medical | 815-000002-S2 | |
Stellate Harmonie | Natus | HSYS-REC-LT2 | |
Swivel connector | Crist Instrument Company Inc. | 4-TBC-9-S |