تصف هذه المقالة بروتوكولا للتلاعب بالأهداف الجزيئية في قشرة الدماغ باستخدام الفيروسات المرتبطة بال أدينو ورصد آثار هذا التلاعب أثناء اليقظة والنوم باستخدام التسجيلات الكهربائية.
استخدام التسجيلات الكهربائية القشرية (ECoG) في القوارض ذات الصلة لأبحاث النوم ودراسة مجموعة واسعة من الحالات العصبية. تستخدم الفيروسات المرتبطة بال أدينو (AAVs) بشكل متزايد لتحسين فهم دوائر الدماغ ووظائفها. كان التلاعب بوساطة AAV لخلايا محددة و / أو المكونات الجزيئية الدقيقة مفيدا للغاية لتحديد الدوائر التنظيمية للنوم الجديدة / الجزيئات والبروتينات الرئيسية التي تساهم في الآثار السلبية لفقدان النوم. على سبيل المثال، يمنع تثبيط نشاط الكوفلين البروتيني الخيطي الذي يقطع أكتين باستخدام AAV ضعف الذاكرة الناجم عن الحرمان من النوم. هنا، يتم وصف بروتوكول يجمع بين التلاعب في وظيفة كوفلين في منطقة قشرة الدماغ مع تسجيل نشاط ECoG لدراسة ما إذا كان الكفيلين القشري يعدل إشارات ECoG اليقظة والنوم. يتم إجراء حقن AAV خلال نفس العملية الجراحية مثل زرع أقطاب ECoG والكهربائية (EMG) في الفئران البالغة من الذكور والإناث. الفئران مخدرة ورؤوسها حليقة بعد تنظيف الجلد وشق، يتم تحديد إحداثيات ستيريوتاكسيك من القشرة الحركية، ويتم ثقب الجمجمة في هذا الموقع. يتم وضع قنية مملوءة مسبقا مع AAV التعبير عن كوفلينS3D، وهو شكل غير نشط من كوفلين ، ببطء في الأنسجة القشرية. بعد ضخ AAV ، يتم تثبيت البراغي المغطاة بالذهب (أقطاب ECoG) من خلال الجمجمة وترسيخها في الجمجمة مع إدخال أسلاك ذهبية في عضلات الرقبة (أقطاب EMG). يسمح للحيوانات ثلاثة أسابيع للتعافي وضمان التعبير الكافي عن cofilinS3D. يتم التحقق من المنطقة المصابة ونوع الخلية باستخدام الكيمياء المناعية ، ويتم تحليل ECoG باستخدام التحديد البصري لولايات اليقظة والتحليل الطيفي. وباختصار، فإن هذا النهج المنهجي المشترك يسمح بالتحقيق في المساهمة الدقيقة للمكونات الجزيئية التي تنظم مورفولوجيا الخلايا العصبية والاتصال بتنظيم نشاط قشرة الدماغ المتزامنة أثناء اليقظة والنوم.
تستخدم تسجيلات تخطيط الدماغ الكهربائي (أو الكهربائي الكهربائي عموما [ECoG] في القوارض) والتسجيلات الكهربية (EMG) على نطاق واسع في أبحاث النوم وكذلك على نطاق أوسع في علم الأعصاب والأعصاب والطب النفسي. في تركيبة, هذه الإشارات الكهربية تسمح لتحديد الدول اليقظة والتحديد الكمي اللاحقة لمدة الدولة وتكوين الطيفية, على حد سواء في البشر والقوارض1,2,3,4. وقد كان هذا القياس الكمي مفيدا لفهم كيفية تعديل النوم في الحالات المرضية مثل الأمراض العصبية والنماذج5و6و7 أو عن طريق التعديل الوراثي8و9. على سبيل المثال، تبين أن خروج المغلوب (KO) من الجينات المختلفة المرتبطة بالاتصالات العصبية لتغيير مدة اليقظة والنوم في كل من الماوس والفاكهة يطير10،11،12،13. لمعالجة التعويض التنموي المحتمل الناشئ عن دراسة KO كامل الجسم في القوارض والسماح للسيطرة الدقيقة على التلاعب الجيني ، فإن الطريقة الفعالة للتلاعب بالتعبير الجيني هي استخدام الفيروسات المرتبطة بال أدينو (AAVs). ويمكن استخدام التلاعب الجيني AAV بوساطة إلى أسفل أو upregulate هدف جزيئي معين وتقييد التلاعب إلى مجموعة خلايا محددة باستخدام أنواع مختلفة من المروجين14. AAVs تستخدم أيضا على نطاق واسع كوسيلة التسليم في تتجمع بانتظام بين متباعدة يكرر palindromic قصيرة (CRISPR) / Cas9 التكنولوجيا15،16. وتسمح هذه المنهجيات بتحسين التحكم الزمني والمكاني في التلاعب الجيني، الذي يرتبط عموما بتعبير المراسل الذي يسمح بالقياز الكمي للمنطقة المصابة باستخدام الفلورة المناعية.
AAVs تمثل أيضا الناقل الرئيسي للتلاعب نوع الخلية الخاصة من نشاط الخلايا العصبية عن طريق علم الوراثة البصرية وchemogenetics17,18,19, التي استخدمت على نطاق واسع في البحوث الحديثة على الأمراض العصبية, سلوك, الإدراك, والنوم20,21,22. في أبحاث النوم ، كان تطبيق علم الوراثة البصرية لتنشيط أو تثبيط مناطق معينة من الدماغ ، مثل الدماغ الأمامي القاعدي ، وتحت المهاد ، وtegmentum تحت الأضلاع ، مفيدا لتحديد أدوارهم في التحكم في الإثارة ، والنوم البطيء الموجة (المعروف أيضا باسم النوم غير السريع لحركة العين) ، والنوم (أو النوم السريع لحركة العين) ، والكاتابلكسي23، 24،25. وعلاوة على ذلك، ساعدت التلاعبات بوساطة AAV في توضيح الدوائر التنظيمية الهامة للنوم والجزيئات التي تساهم في الآثار السلبية لفقدان النوم26و27و28. على سبيل المثال، بروتين واحد تبين أن متورطة في ضعف الذاكرة الناجم عن الحرمان من النوم هو كوفلين29،30. هذا البروتين هو بروتين قطع أكتين خيوط التي تشارك في إعادة تنظيم خيوط أكتين عن طريق ملزمة جسديا إلى أكتين وتعزيز تفكيك خيوط بطريقة ديناميكية31. تثبيط نشاط كوفلين باستخدام نهج AAV بوساطة ثبت لمنع فقدان العمود الفقري، فضلا عن اللدونة متشابك والعجز في الذاكرة الناجمة عن الحرمان من النوم في الفئران29. بشكل جماعي ، تؤكد هذه الدراسات على فائدة وأهمية التلاعب بوساطة AAV لفهم تنظيم النوم وعواقب الحرمان من النوم في القوارض.
هنا ، يتم وصف بروتوكول يجمع بين زرع قطب ECoG و EMG والتسجيل مع التلاعب بوظيفة الكفيلين في منطقة قشرة الدماغ من الفئران البرية (WT) باستخدام AAV. وبشكل أكثر دقة، يتم حقن AAV (النمط المصلي 9) الذي يعبر عن تسلسل الترميز لشكل فوسفوميميتيك من كوفلين الماوس (cofilinS3D)،مما يجعله غير نشط32،33، في قشرة المحرك (M1 و M2). يتم زرع قطب ECoG مباشرة في موقع الحقن لضمان تسجيل النشاط القشري المتزامن للخلايا المصابة. يتم إجراء تسجيل ECoG / EMG لمدة 24 ساعة في ظل ظروف غير مضطربة بعد ثلاثة أسابيع من الجراحة للسماح بالتعافي والتكيف والتعبير العالي عن cofilinS3D. ثم يستخدم التسجيل لتحديد حالات اليقظة والتحليل الطيفي ECoG ، كما هو موضح في الدراسات السابقة11،34. يمكن أن تكشف هذه المنهجية على وجه التحديد كيف يعدل الكفيل القشري اليقظة وإشارات ECoG أثناء النوم في الفئران. هذا المزيج من التسجيلات الكهربية والتلاعب الجيني بوساطة AAV وثيق الصلة بشكل خاص للتحقيق في أدوار العناصر الجزيئية المختلفة في وظائف الدماغ المحددة ويمكن تطبيقه على منطقة الدماغ القشرية (وشبه القشرية) ذات الاهتمام في WT والفئران المعدلة وراثيا من كلا الجنسين وحتى الأنواع الأخرى.
يصف هذا البروتوكول طريقة دقيقة ومباشرة لمراقبة نشاط ECoG و EMG أثناء التلاعب بالأهداف الجزيئية باستخدام AAVs. للمقارنة الكافية بين المجموعات، يوصى بشدة بالتخطيط دائما للإجراءات الجراحية (حقن AAV وزرع الأقطاب الكهربائية) في نفس اليوم لاختبار الحيوانات والتحكم فيها، وتسجيل إشاراتها الكهربية في وقت واحد. للحصول على تعبير فيروسي مماثل بين الاختبار والتحكم ، من المستحسن حقن نفس التيتر الفيروسي. في هذه الحالة، انخفض titer الفيروسية للسيطرة AAV إلى نصف اختبار AAV لضمان التعبير الفيروسي مماثلة. يجب على المجربين توخي الحذر الشديد مع قياسات الإحداثيات الاستريوتاكسيكية لضمان انخفاض التباين بين الحيوانات في منطقة الدماغ / استهداف الطبقة القشرية. بالإضافة إلى ذلك ، بالنظر إلى أن عمق الحقن يتم حسابه من سطح الجمجمة ، وأن سمك الجمجمة يختلف باختلاف العمر والجنس ، يجب دائما التحقق من وضع القنية باستخدام علم الأنسجة بعد البروتوكول أو الكيمياء المناعية (على سبيل المثال ، الشكل 2)لضمان تحديد المواقع / عمق الحقن بشكل كاف ، وينبغي تعديل الإحداثيات الاستريوتاكسيكية إذا لزم الأمر. في جميع أنحاء حقن AAV 40 دقيقة، من المهم جدا لرصد سرعة الحقن للكشف بسرعة وتصحيح القضايا المحتملة مثل انسداد المضخة. بعض الخطوات التجريبية هي أيضا حاسمة للحصول على إشارات الفيزيولوجيا الكهربائية الأمثل. على سبيل المثال، لا يفرط في crew أثناء زرع القطب. يجب أن تخرج البراغي من الجمجمة بمقدار 2.5 ملم على الأقل لتقليل الأضرار التي لحقت بالقشرة الدماغية وتشكيل ندبة جلتية. بعد ذلك ، من المهم للغاية أيضا أن أ) تجنب تطبيق الأسمنت على أطراف الأقطاب الكهربائية ، 2) ضمان لحام سريع للأقطاب الكهربائية إلى الموصل ، و3) تأكد من عدم وجود اتصال بين الأقطاب الكهربائية.
الإجراء المعروض هنا لتسجيل ECoG و EMG راسخ للغاية وبسيط ويستخدم على نطاق واسع لمراقبة اليقظة والنوم في الفئران2و11و13و34. يمكن إجراء تسجيلات ECoG و EMG المستمرة لعدة أيام متتالية (وحتى أسابيع) وتوليد مجموعة بيانات غنية جدا يمكن استخدامها لأداء عدة خطوط من التحليل تتضمن متغيرات تتعلق باليقظة وكمية النوم والهندسة المعمارية2و11و12 (على سبيل المثال ، الوقت الذي يقضيه في حالات مختلفة لكل فترات ضوئية ومظلمة ، وعدد الحلقات في كل ولاية ، توزيع النوم على مدار 24 ساعة) واليقظة والمحتوى الطيفي للنوم34و41 (على سبيل المثال، الطاقة في نطاقات تردد مختلفة [على غرار الشكل 3]،والنشاط الخالي من النطاق)، وخصائص الموجات الفردية42و43و44 (على سبيل المثال، اتساع الموجة البطيئة والمنحدر). عند استخدامها في تركيبة مع التلاعب الجزيئي بوساطة AAV ، فإن الميزة الإضافية هي تجنب التعويض التنموي المحتمل الذي يمكن أن يحدث في الحيوانات المعدلة وراثيا. مع الممارسة، يمكن إجراء الإجراء كله، بما في ذلك حقن AAV 40 دقيقة، في حوالي 90 دقيقة. يجب أن يكون معدل الوفيات منخفضا (جدا) لأن الجراحة طفيفة التوغل.
الاستخدام المتزامن لتسجيل ECoG / EMG والتلاعب المستهدف مع AAV يوفر مجموعة متنوعة من المزايا والتطبيقات الأخرى. فعلى سبيل المثال، تكون دقة الاستهداف الاستريوتاكزي، عند أدائها على نحو كاف، عالية جدا ويمكن تكرارها ومفيدة لتحديد الدور المحدد لمنطقة معينة من الدماغ (و/أو نوع الخلية أو عنصر جزيئي داخل المنطقة) في تنظيم النوم أو العمليات الفسيولوجية الأخرى. وبالتالي يمكن استهداف العديد من المناطق القشرية المختلفة بسهولة باستخدام تعديلات البروتوكول الحالي. وعلاوة على ذلك، يمكن توجيه عمليات التلاعب المستهدفة باستخدام مركبات الكربون الهيدروفلورية إلى منطقة قشرية/تحت القشرية تختلف عن مواقع تسجيل المركبات الكهربائية. في مثل هذه الحالات، يمكن تغطية ثقب التجشؤ لحقن AAV بواسطة غطاء زجاجي صغير ثابت باستخدام أسمنت الأسنان (أو شمع العظام). لتعزيز خصوصية، وبناء AAV غالبا ما يتضمن المروج الذي يسمح العدوى المستهدفة من نوع الخليةالدقيقة 14. تم استخدام مروج CamKIIα في البروتوكول الحالي لاستهداف الخلايا الهرمية المثيرة14و29و45على وجه التحديد من قشرة المحرك. وقد مكنت هذه الاستراتيجية تعطيل cofilin (باستخدام cofilinS3D)32،33 في الخلايا العصبية مثير من القشرة الحركية ومراقبة التغيرات الخاصة للدولة في نشاط ECoG ( الشكل3). لتقييم فعالية العدوى / النقل ، يمكن لمستخدمي البروتوكول في المستقبل الجمع بين بروتوكول AAV-ECoG المقدم مع واحد من التلطيخ المشترك عن طريق الفلورة المناعية ، واستخدام صور التكبير العالية لحساب عدد الخلايا التي تظهر وضع علامات مزدوجة من العدد الإجمالي للخلايا التي تظهر وسمة واحدة للهدف (هنا ، الخلايا العصبية المعبرة عن CaMKIIα). في دراسة حديثة، تم استخدام طريقة AAV-ECoG مماثلة لتلك الموصوفة هنا للإفراط في التعبير عن البروتين الهش المرتبط بمتلازمة التخلف العقلي X 1 (FXR1) في جميع الخلايا العصبية في القشرة الحركية باستخدام AAV يحتوي على مروج synapsin وكشف عن تأثير هذا التلاعب على توزيع حالة اليقظة والمحتوى الطيفي28. توضح هذه النتائج كيف يمكن أن يكشف التلاعب بجزيء معين في منطقة الدماغ المستهدفة باستخدام AAVs عن أدوار في تنظيم معلمات اليقظة / النوم المحددة.
أحد قيود البروتوكول الموصوف هو الآفة الصغيرة لأنسجة الدماغ التي تحدث مع وضع القنية قبل إجراء حقن AAV ، والتي يمكن أن تكون مصحوبة أيضا باستجابة التهابية. وهذا يمكن أن يكون مصدر قلق خاص عند إجراء حقن AAV في المناطق تحت القشرية وينبغي دائما معالجتها باستخدام ضوابط كافية. وبدلا من ذلك، يمكن أن يتبع البروتوكول الحالي تحديد كمي للغليوسيس التفاعلي و/أو التنشيط المجهري (على سبيل المثال، استخدام الفلورة المناعية) لضمان مستويات مماثلة في مجموعات التحكم والاختبار، وبالتالي، على قراءات مجموعة ال ECoG. ويتعلق القيد الثاني بخطر وجود اتصال سيئ بين القطب الكهربائي والموصل، مما قد يؤدي إلى إشارة كهربية كهربية سيئة باستمرار أو في بعض الأحيان. سوف مشدود بقوة، لحام، والأقطاب الكهربائية عززت تقليل وقوع هذه المسألة. ويرتبط القيد الثالث بالحيوانات التي يتم ربطها عبر مونتاج الرأس أثناء التسجيل ، مما قد يحد من الحركة والسلوكيات الأخرى ، على الأقل إلى حد ما ، ويؤدي أحيانا إلى تلف الكابلات وفقدان الإشارة. وأخيرا، فإن البروتوكول المعروض هو أكثر ملاءمة للفئران البالغة، بالنظر إلى أن حجم الجمجمة للحيوانات الأصغر سنا قد يسبب صعوبات في تركيب المونتاج الرأس يصور، كما هو موضح سابقا2.
كما ينطبق تسجيل ECoG/EMG المشترك والتلاعب بوساطة AAV لهدف دقيق على مجالات البحث بخلاف علم الأعصاب للنوم. من بين أمور أخرى، يمكن استخدامه لدراسة والتلاعب أحداث الصرع في النماذج الحيوانية من الاستيلاء وهو أداة قوية لتعديل ذبذبات الدماغ المشاركة في ترميز الذاكرة وتوطيد46،47. وبناء على ذلك، تشمل التطبيقات المحتملة بالتأكيد مجالات البحوث الأساسية في الطب النفسي والأعصاب، بما في ذلك الأمراض العصبية. بالإضافة إلى القدرة على التعبير عن شكل غير نشط من جزيء، يمكن أن تستخدم AAVs وقد استخدمت للتعبير المفرط أو downregulate (على سبيل المثال، الجيش الملكي النيبالي الصغيرة التدخل، CRISPR/Cas9) أو لإنقاذ التعبير عن جزيء في KO كامل الجسم. الأهم من ذلك ، فإن المنهجية المزدوجة للبروتوكول الحالي تنطبق أيضا على أنواع الثدييات الأخرى مثل الفئران والقوارض النهارية التي تمثل نماذج مثيرة للاهتمام لفهم كل من النوم والتنكس العصبي48،49.
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل العمل من قبل كرسي البحوث الكندية في علم وظائف الأعضاء الجزيئية النوم. ويشكر المؤلفان كلوي بروفوست وكارولين بوشار على المساعدة التقنية.
Surgery peparation | |||
21 G needle | Terumo | NN-2125R | |
6-channel connector | ENA AG | BPHF2-O6S-E-3.2 | Connector used in this manuscript, but discontinued. See potential replacement below |
Distrelec | 300-93-672 | Potential replacement for discontinued connector above | |
C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | 000664 | B6 | Animals bred on site |
Pluronic F-68 | Non-ionic surfactant | ||
Gold wire 0.2 mm diameter | Delta scientific | 920-862-41 | Non-insulated |
Hamilton syringe (10 μL) | Fisher Scientific | 14815279 | |
Infusion syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
Injection cannula 28 G | Plastics one | C313l-SPCL | |
Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
Ketamine (10 mg/mL) | SANDOZ | 4550 | |
Lead-free solder | AIM | SN100C | |
Lubricating ophthalmic ointment | ALLERGAN | 210889 | |
PE 50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
Flat fillister head self tapping screws | MORRIS | FF00CE125 | ECoG electrode gold covered; Dimension : 1.9 mm head diameter, 1.14 mm thread major diameter, 3.6 mm length |
Soldering iron | Weller | WES51 | |
Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
Trimmer | Harvard Apparatus | 72-9063 | |
Xylazine (20 mg/mL) | Bayer | 2169592 | |
Intracortical AAV injection with syringe pump | |||
0.7 mm drill bit | Dremel | 628 | |
AAV9-CaMKIIα0.4-cofilinS3D-HA | UPenn Viral Core | ||
AAV9-CaMKIIα0.4-eGFP | UPenn Viral Core | ||
Cotton tippped applicators | Medicom | 806 | |
Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
Extra-fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Stereotaxic arm | Stoelting | 51604U | |
Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
Surgical clamps | Fine science tools | 18050-28 | |
Tissue scissor | Magna Stainless | M4-124 | |
ECoG/EMG electrode implantation | |||
Buprenorphine (0.3 mg/mL) | CEVA | 57133-02 | |
Curved forceps | Fine science tools | 11001-12 | |
Delicate task wipers | Kimtech | 34120 | |
Dental acrylic cement | Yates Motloid | 44115 | |
Dumont #5 forceps | Fine science tools | 91150-20 | |
Extra fine Graefe forceps | Fine science tools | 11150-10 | |
Kelly forceps | Fine science tools | 13002-10 | |
Liquid acrylic | Yates Motloid | 44119 | |
Monocryl plus suture needle 13 mm 3/8c rev cutting | Ethicon | MCP494 | |
Providone-iodine 10% | Triad disposables | 10-8208 | |
RelyX Unicem 2, Adhesive Resin Cement A2 | 3M | 56849 | |
Immunofluorescence and ECoG recording | |||
36-Channel EEG Wearable Headbox | LaMONT Medical | 832-000350 | |
CaMKII alpha Monoclonal Antibody (Cba-2) | Invitrogen | 13-7300 | Dilution 1:500 |
Conductors Awg PVC Insulation Cable | Calmont Wire & Cables | HC-0819075R0 | |
Donkey anti-Mouse IgG secondary Ab, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilution 1:1000 |
Goat anti-Rabbit IgG secondary Ab, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | Dilution 1:500 |
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb | Cell signaling | 3724 | Dilution 1:800 |
Programmable Amplifier | LaMONT Medical | 815-000002-S2 | |
Stellate Harmonie | Natus | HSYS-REC-LT2 | |
Swivel connector | Crist Instrument Company Inc. | 4-TBC-9-S |