Summary

Análise de repertório imune do receptor de células T e B usando sequenciamento de última geração

Published: January 12, 2021
doi:

Summary

O protocolo atual descreve um método de isolamento de DNA a partir de amostras de sangue e biópsias intestinais, geração de bibliotecas TCRβ e IGH PCR para sequenciamento de próxima geração, desempenho de uma execução de NGS e análise de dados básicos.

Abstract

A memória imunológica, a marca registrada da imunidade adaptativa, é orquestrada por linfócitos T e B. Em circulação e diferentes órgãos, há bilhões de clones de células T e B únicos, e cada um pode ligar um antígeno específico, levando à proliferação, diferenciação e/ou secreção de citocinas. A grande heterogeneidade nas células T e B é gerada pela recombinação aleatória de diferentes segmentos genéticos. As tecnologias de sequenciamento de última geração (NGS), desenvolvidas na última década, permitem uma visão aprofundada sem precedentes do repertório imunológico do receptor de células T e B. Estudos em várias condições inflamatórias, imunodeficiências, infecções e malignidades demonstraram mudanças acentuadas na clonalidade, uso genético e propriedades biofísicas do repertório imunológico, fornecendo importantes insights sobre o papel das respostas imunes adaptativas em diferentes distúrbios.

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para NGS de repertório imunológico de células T e B a partir de sangue e tecido. Apresentamos um pipeline a partir do isolamento do DNA através da preparação da biblioteca, sequenciamento no sequenciador NGS e terminando com análises básicas. Este método permite a exploração de células T e B específicas no nível nucleotídeo ou aminoácido, podendo assim identificar mudanças dinâmicas nas populações de linfócitos e parâmetros de diversidade em diferentes doenças. Esta técnica está entrando lentamente na prática clínica e tem potencial para identificação de novos biomarcadores, estratificação de risco e medicina de precisão.

Introduction

O sistema imunológico adaptativo, composto por linfócitos T e B, utiliza memória imunológica para reconhecer um antígeno previamente encontrado e iniciar uma resposta rápida. Os linfócitos são gerados na medula óssea e maduros nas células timo (células T) ou medula óssea (células B). Tanto o receptor de células T (TCR) quanto o receptor de células B (BCR) exibem configurações únicas que permitem o reconhecimento de antígenos específicos. Na homeostase, as células T e B circulam constantemente e pesquisam os trilhões de peptídeos diferentes apresentados em células que apresentam antígenos. A ligadura TCR ou BCR de um antígeno específico com alta afinidade, juntamente com a co-estimulação adequada, leva à ativação celular, resultando em secreção de citocinas, expansão clonal e geração de anticorpos, no caso de células B.

A enorme matriz das diferentes células T ou B é coletivamente denominada repertório imunológico, permitindo o reconhecimento de incontáveis epítopos diferentes. A fim de gerar um repertório tão vasto, ocorre um complexo processo de montagem aleatória de diferentes segmentos genéticos, criando combinações quase infinitas de receptores que podem ligar antígenos únicos1. Esse processo, chamado de recombinação V(D)J, inclui rearranjos de diferentes genes variáveis (V), diversidade (D) e junção (J), acompanhados de supressões aleatórias e inserções de nucleotídeos nas junções2.

A arquitetura do sistema imunológico adaptativo tem interessado cientistas em diferentes campos por muitas décadas. No passado, o sequenciamento de Sanger, a especificação da região 3 (CDR3) complementar e a citometria de fluxo foram utilizados para caracterizar o repertório imunológico, mas proporcionavam baixa resolução. Na última década, os avanços nos métodos de sequenciamento de próxima geração (NGS) permitiram uma visão aprofundada das características e composição dos repertórios TCR e BCR de um indivíduo3,4. Esses sistemas de alta produtividade (HTS) sequenciam e processam milhões de produtos TCR ou BCR reorganizados simultaneamente e permitem uma análise de alta resolução de células T e B específicas no nível nucleotídeo ou aminoácido. A NGS fornece uma nova estratégia para estudar o repertório imunológico tanto na saúde quanto na doença. Estudos utilizando HTS demonstraram repertórios alterados de TCR e BCR em doenças autoimunes5, imunodeficiências primárias6,7e malignidades, como na leucemia mielóide aguda8. Utilizando NGS, nós e outros mostramos expansão oligoclonal de clones específicos de células T e B, em pacientes com doença inflamatória intestinal (DII), incluindo colite ulcerativa e doença de Crohn9,10,11,12,13,14. No geral, estudos de diferentes campos sugerem que mudanças no repertório têm um papel crucial na patogênese de distúrbios imunomu mediados.

O protocolo atual descreve um método de isolamento do DNA de biópsias intestinais e sangue, geração de bibliotecas TCRβ e IGH PCR para NGS, e desempenho de sequenciamento executado. Também fornecemos passos básicos na análise de dados do repertório imunológico. Este protocolo também pode ser aplicado para a geração de bibliotecas TCRα, TCRγ e IGL. O método também é compatível com outros órgãos (por exemplo, linfonodos, tumores, fluido sinovial, tecido adiposo, etc.) desde que sejam utilizados protocolos de digestão específicos do tecido.

Protocol

Este estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional do Sheba Medical Center, e o consentimento por escrito informado foi obtido de todos os sujeitos participantes. 1. Isolamento e quantificação do DNA Digestão e lise celular de biópsias intestinais Recuperar biópsias intestinais, coletadas recentemente ou armazenadas a -20 °C ou -80 °C. Se usar biópsias congeladas, descongele no gelo. Adicione 600 μL de solução de lise nuclei a um tubo de m…

Representative Results

Aqui, descrevemos um método para isolamento do DNA do tecido intestinal e sangue, preparação de bibliotecas para NGS, e etapas básicas de um sequenciamento para sequenciamento do repertório imunológico. A execução gerará arquivos fastq, que podem ser convertidos em arquivos fasta para uso na plataforma internacional IMGT)/HighV-QUEST. Este HTS realiza e gerencia muitas análises de dezenas de milhares de sequências TCRβ e IGH reorganizadas, no nível nucleotídeo15. O IMGT/HighV-QUEST p…

Discussion

Alterações na abundância e função de linfócitos B e T são frequentemente encontradas em diferentes malignidades18, distúrbios inflamatórios crônicos (por exemplo, colite ulcerativa e artrite reumatoide)10,19, e em várias imunodeficiências17,20. O método atual utiliza o NGS para facilitar uma visão aprofundada dos repertórios TCR e BCR, permitindo a detecção de alte…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

nenhum.

Materials

2-propanol Sigma I9516-500ML
1.7 mL micro-centrifuge tubes Axygen 8187631104051
15 mL centrifuge tubes Greiner 188261
Absolute ethanol Merck 1.08543.0250
Amplitaq Gold Thermo Fisher N8080241
AMPure XP Beads Beckman Coulter A63881
Heat block Bioer Not applicable
High Sensitivity D1000 Sample Buffer Agilent 5067-5603 For Tapestation
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent 5067-5584 For Tapestation. Tubes sold seperately
Lymphotrack Assay kit Invivoscribe TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 Each includes 24 indexes
MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) Illumina MS-102-2003 Includes standard flow cell type and all reagents required
MiSeq Sequencer Illumina SY-410-1003
PCR strips 4titude 4ti-0792
Proteinase K Invitrogen EO0491
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Q33226
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32854 Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes
Shaker Biosan Not applicable
Tapestation 2100 Bioanalyzer Agilent G2940CA
ultra pure water Bio-lab 7501
Wizard DNA isolation kit Promega A1120 Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Werner, L., Dor, C., Salamon, N., Nagar, M., Shouval, D. S. T and B Cell Receptor Immune Repertoire Analysis using Next-generation Sequencing. J. Vis. Exp. (167), e61792, doi:10.3791/61792 (2021).

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