Yeni Nesil Dizileme Kullanılarak T ve B Hücre Reseptörü İmmün Repertuar Analizi
Summary
Mevcut protokol, kan örnekleri ve bağırsak biyopsilerinden DNA izolasyonu, yeni nesil sıralama için TCRβ ve IGH PCR kütüphanelerinin üretimi, bir NGS çalışmasının performansı ve temel veri analizi için bir yöntem tanımlamaktadır.
Abstract
Adaptif bağışıklığın ayırt edici özelliği olan immünolojik hafıza, T ve B lenfositleri tarafından düzenlenmiştir. Dolaşımda ve farklı organlarda milyarlarca benzersiz T ve B hücre klonu vardır ve her biri belirli bir antijeni bağlayarak çoğalmaya, farklılaşmaya ve/veya sitokin salgılanmasına yol açabilir. T ve B hücrelerindeki geniş heterojenlik, farklı genetik segmentlerin rastgele rekombinasyonu ile oluşur. Son on yılda geliştirilen yeni nesil dizileme (NGS) teknolojileri, T ve B hücre reseptör immün repertuarının eşi görülmemiş bir derinlemesine görünümünü sağlıyor. Çeşitli inflamatuar durumlar, immün yetmezlikler, enfeksiyonlar ve malignitelerde yapılan çalışmalar, bağışıklık repertuarının klonalite, gen kullanımı ve biyofiziksel özelliklerinde belirgin değişiklikler göstererek, adaptif immün yanıtların farklı bozukluklardaki rolü hakkında önemli bilgiler sağlamıştır.
Burada, kan ve dokudan T ve B hücrelerinin bağışıklık repertuarının NGS için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Kütüphane hazırlığı, NGS sıralayıcı üzerinde sıralama ve temel analizlerle biten DNA izolasyonundan başlayarak bir boru hattı sunuyoruz. Bu yöntem, nükleotid veya amino-asit düzeyinde spesifik T ve B hücrelerinin araştırılmasını sağlar ve böylece lenfosit popülasyonlarındaki dinamik değişiklikleri ve farklı hastalıklardaki çeşitlilik parametrelerini tanımlayabilir. Bu teknik yavaş yavaş klinik uygulamaya giriyor ve yeni biyobelirteçlerin tanımlanması, risk tabakalaşması ve hassas tıp potansiyeline sahip.
Introduction
T ve B lenfositlerden oluşan adaptif bağışıklık sistemi, daha önce karşılaşılan bir antijeni tanımak ve hızlı bir yanıt başlatmak için immünolojik hafızayı kullanır. Lenfositler kemik iliğinde üretilir ve timusta (T hücreleri) veya kemik iliğinde (B hücreleri) olgunlaşır. Hem T hücre reseptörü (TCR) hem de B hücre reseptörü (BCR), belirli antijenlerin tanınmasını sağlayan benzersiz konfigürasyonlar görüntüler. Homeostazda, T ve B hücreleri antijen sunan hücrelerde sunulan trilyonlarca farklı peptidi sürekli dolaşıma sokar ve inceler. Yüksek benzeşimli belirli bir antijenin TCR veya BCR ligasyonu, uygun ko-stimülasyon ile birlikte hücre aktivasyonuna yol açar ve B hücreleri durumunda sitokin salgılanması, klonal genişleme ve antikorların üretilmesine neden olur.
Farklı T veya B hücrelerinin muazzam dizisi, sayısız farklı epitopun tanınmasını sağlayan toplu olarak bağışıklık repertuarı olarak adlandırılmıştır. Böylesine geniş bir repertuar oluşturmak için, farklı gen segmentlerinin rastgele montajının karmaşık bir süreci gerçekleşir ve benzersiz antijenleri bağlayabilen reseptörlerin neredeyse sonsuz kombinasyonları oluşturulur1. V(D)J rekombinasyonu olarak adlandırılan bu işlem, kavşaklarda rastgele silmeler ve nükleotid eklemeleri eşliğinde farklı değişken (V), çeşitlilik (D) ve birleştirme (J) genlerinin yeniden düzenlenmesini içerir2.
Adaptif bağışıklık sisteminin mimarisi, bilim insanlarını uzun yıllardır farklı alanlarda ilgilendirmektedir. Geçmişte, Sanger dizilimi, tamamlayıcı belirleyici bölge 3 (CDR3) spektratilleme ve akış sitometrisi bağışıklık repertuarını karakterize etmek için kullanıldı, ancak düşük çözünürlük sağladı. Son on yılda, yeni nesil dizileme (NGS) yöntemlerindeki gelişmeler, bireyin TCR ve BCR repertuarlarının özellikleri ve kompozisyonu hakkında derinlemesine içgörü sağladı3,4. Bu yüksek verimli sistemler (HTS) milyonlarca yeniden düzenlenmiş TCR veya BCR ürününü aynı anda sıralar ve işler ve nükleotid veya amino asit seviyesindeki belirli T ve B hücrelerinin yüksek çözünürlüklü analizine izin verir. NGS, hem sağlık hem de hastalıkta bağışıklık repertuarını incelemek için yeni bir strateji sağlar. HTS kullanılarak yapılan çalışmalarda otoimmün hastalıklar5,primer immün yetmezlikler6,7ve akut miyeloid lösemi8gibi malignitelerde değişen TCR ve BCR repertuarları gösterilmiştir. NGS kullanarak, biz ve diğerleri, ülseratifkolit ve Crohn hastalığı 9 , 10 , 11, 12,13,14dahil olmak üzere enflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) olan hastalarda spesifik T ve B hücre klonlarının oligoklonal genişlemesini gösterdik. Genel olarak, farklı alanlardan yapılan çalışmalar, repertuardaki değişikliklerin bağışıklık aracılı bozuklukların patogenezinde çok önemli bir role sahip olduğunu göstermektedir.
Mevcut protokol, DNA’nın bağırsak biyopsilerinden ve kanından izole edilmesini, NGS için TCRβ ve IGH PCR kütüphanelerinin üretilmesini ve sıralama çalışmasının performansını açıklar. Ayrıca bağışıklık repertuar veri analizinde temel adımlar sağlıyoruz. Bu protokol TCRα, TCRφ ve IGL kitaplıklarının üretimi için de uygulanabilir. Yöntem, dokuya özgü sindirim protokolleri kullanıldığı sürece diğer organlarla (örneğin lenf düğümleri, tümörler, sinovyal sıvı, yağ dokusu vb.) uyumludur.
Protocol
Representative Results
Discussion
B ve T lenfositlerinin bolluğunda ve işlevinde değişikliklere genellikle farklı malignitelerde rastlanır18, kronik inflamatuar bozukluklar (örneğin, ülseratif kolit ve romatoid artrit)10,19ve çeşitli immün yetmezliklerde17,20. Mevcut yöntem, TCR ve BCR repertuarlarının derinlemesine görünümünü kolaylaştırmak için NGS’yi kullanır, T ve B hücre klonalitesinde…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
hiç kimse.
Materials
| 2-propanol | Sigma | I9516-500ML | |
| 1.7 mL micro-centrifuge tubes | Axygen | 8187631104051 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188261 | |
| Absolute ethanol | Merck | 1.08543.0250 | |
| Amplitaq Gold | Thermo Fisher | N8080241 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Heat block | Bioer | Not applicable | |
| High Sensitivity D1000 Sample Buffer | Agilent | 5067-5603 | For Tapestation |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | For Tapestation. Tubes sold seperately |
| Lymphotrack Assay kit | Invivoscribe | TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019 | Each includes 24 indexes |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | Includes standard flow cell type and all reagents required |
| MiSeq Sequencer | Illumina | SY-410-1003 | |
| PCR strips | 4titude | 4ti-0792 | |
| Proteinase K | Invitrogen | EO0491 | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher | Q33226 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32854 | Includes buffer, dye, standards, and specialized tubes |
| Shaker | Biosan | Not applicable | |
| Tapestation 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2940CA | |
| ultra pure water | Bio-lab | 7501 | |
| Wizard DNA isolation kit | Promega | A1120 | Includes cell lysis solution, nuclei lysis solution, and protein precipitation buffer |
Riferimenti
- Bassing, C. H., Swat, W., Alt, F. W. The mechanism and regulation of chromosomal V(D)J recombination. Cell. 109, 45-55 (2002).
- Roth, D. B. V(D)J Recombination: Mechanism, Errors, and Fidelity. Microbiology Spectrum. 2 (6), (2014).
- Heather, J. M., Ismail, M., Oakes, T., Chain, B. High-throughput sequencing of the T-cell receptor repertoire: pitfalls and opportunities. Brief Bioinformatics. 19 (4), 554-565 (2018).
- Pabst, O., Hazanov, H., Mehr, R. Old questions, new tools: does next-generation sequencing hold the key to unraveling intestinal B-cell responses. Mucosal Immunology. 8 (1), 29-37 (2015).
- Bashford-Rogers, R. J. M., Smith, K. G. C., Thomas, D. C. Antibody repertoire analysis in polygenic autoimmune diseases. Immunology. 155 (1), 3-17 (2018).
- Lee, Y. N., et al. Characterization of T and B cell repertoire diversity in patients with RAG deficiency. Science Immunology. 1 (6), (2016).
- Werner, L., et al. Alterations in T and B Cell Receptor Repertoires Patterns in Patients With IL10 Signaling Defects and History of Infantile-Onset IBD. Frontiers Immunology. 11, 109 (2020).
- Zhang, J., et al. Immune receptor repertoires in pediatric and adult acute myeloid leukemia. Genome Medicine. 11 (1), 73 (2019).
- Chapman, C. G., et al. Characterization of T-cell Receptor Repertoire in Inflamed Tissues of Patients with Crohn’s Disease Through Deep Sequencing. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (6), 1275-1285 (2016).
- Werner, L., et al. Altered T cell receptor beta repertoire patterns in pediatric ulcerative colitis. Clinical and Experimental Immunology. 196 (1), 1-11 (2019).
- Bashford-Rogers, R. J. M., et al. Analysis of the B cell receptor repertoire in six immune-mediated diseases. Nature. 574 (7776), 122-126 (2019).
- Wu, J., et al. Expanded TCRbeta CDR3 clonotypes distinguish Crohn’s disease and ulcerative colitis patients. Mucosal Immunology. 11 (5), 1487-1495 (2018).
- Rosati, E., et al. Identification of disease-associated traits and clonotypes in the T-cell receptor repertoire of monozygotic twins affected by inflammatory bowel diseases. Journam of Crohn’s and Colitis. , (2019).
- Allez, M., et al. T cell clonal expansions in ileal Crohn’s disease are associated with smoking behaviour and postoperative recurrence. Gut. 68 (11), 1961-1970 (2019).
- Li, S., et al. IMGT/HighV QUEST paradigm for T cell receptor IMGT clonotype diversity and next generation repertoire immunoprofiling. Nature Communications. 4, 2333 (2013).
- H, I. J., et al. Strategies for B-cell receptor repertoire analysis in primary immunodeficiencies: from severe combined immunodeficiency to common variable immunodeficiency. Frontiers Immunology. 6, 157 (2015).
- Ghraichy, M., Galson, J. D., Kelly, D. F., Truck, J. B-cell receptor repertoire sequencing in patients with primary immunodeficiency: a review. Immunology. 153 (2), 145-160 (2018).
- Zhuang, Y., et al. Application of immune repertoire sequencing in cancer immunotherapy. International Immunopharmacology. 74, 105688 (2019).
- Liu, X., et al. T cell receptor beta repertoires as novel diagnostic markers for systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis. Annual Rheumatic Diseases. 78 (8), 1070-1078 (2019).
- Wong, G. K., Heather, J. M., Barmettler, S., Cobbold, M. Immune dysregulation in immunodeficiency disorders: The role of T-cell receptor sequencing. Journal of Autoimmunity. 80, 1-9 (2017).
- Delhalle, S., Bode, S. F. N., Balling, R., Ollert, M., He, F. Q. A roadmap towards personalized immunology. NPJ System Biology and Applications. 4, 9 (2018).
- Laubli, H., et al. The T cell repertoire in tumors overlaps with pulmonary inflammatory lesions in patients treated with checkpoint inhibitors. Oncoimmunology. 7 (2), 1386962 (2018).
- Hogan, S. A., et al. Peripheral Blood TCR Repertoire Profiling May Facilitate Patient Stratification for Immunotherapy against Melanoma. Cancer Immunology Research. 7 (1), 77-85 (2019).
- Aversa, I., Malanga, D., Fiume, G., Palmieri, C. Molecular T-Cell Repertoire Analysis as Source of Prognostic and Predictive Biomarkers for Checkpoint Blockade Immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), (2020).
- Hirsch, P., et al. Precision and prognostic value of clone-specific minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Haematologica. 102 (7), 1227-1237 (2017).
- De Simone, M., Rossetti, G., Pagani, M. Single Cell T Cell Receptor Sequencing: Techniques and Future Challenges. Frontiers Immunology. 9, 1638 (2018).
- Zemmour, D., et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nature Immunology. 19 (3), 291-301 (2018).
- Zheng, C., et al. Landscape of Infiltrating T Cells in Liver Cancer Revealed by Single-Cell Sequencing. Cell. 169 (7), 1342-1356 (2017).
