Todos los pasos de este protocolo están aprobados y siguen las pautas del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Virginia. NOTA: Hay algunos controles importantes a considerar para pasos de análisis posteriores, que se resumen en la Tabla 1 y deben considerarse antes de la administración de liposomas. 1. Preparación de liposomas marcados con fluorescencia, cargados con acetato de calcio y tesaglitazar Combine DSPC (1,2-distearoil-sn-glycero-3-phosphocholine), colesterol, PEG-2000-DSPE y DiD. Para esto, combine el DSPC, el colesterol y el DSPE PEG-2000 en una proporción de masa de 2: 1: 1. Añadir colorante lipídico DiD a una concentración de 1 mg de DiD por 1 ml de liposomas (relación molar de 46:1 de DSPC:DiD).NOTA: DiD es una abreviatura aceptada para el colorante 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3’tetrametilindocarbocianina. Como tiene dos “colas grasas” de octadecilo de igual longitud que el DSPC utilizado en esta formulación, debe incorporarse principalmente a la membrana lipídica. Los colorantes lipídicos como DiO, DiD y DiI se utilizan rutinariamente para la investigación de liposomas8 y se consideran no intercambiables18. Use un vial de centelleo de 20 ml para la emulsión de fase invertida y la preparación de liposomas. En este vial, mezclar una solución de éter-cloroformo 2:1 de lípidos con acetato de calcio acuoso (acetato de Ca, 1 M, pH 7.4). La relación entre la fase orgánica y acuosa debe ser de 4:1, por ejemplo, 4 ml de fase orgánica y 1 ml de fase acuosa. Emulsionar la solución éter-cloroformo de lípidos por sonicación durante 30 s a temperatura ambiente. Opere el sonicador a 20 KHz y 50% de potencia y use una 1/2 pulgada. sonda.NOTA: Mantenga la punta de la sonda del sonicador más cerca de la parte inferior del vial para evitar la formación de espuma. No toque el vidrio con la punta de la sonda durante la sonicación, puede romperse. Además, el cloroformo debe agregarse al éter como cosolvente: en presencia de colesterol, una emulsión solo de éter se separa rápidamente, lo que hace imposible este paso del procedimiento. Coloque inmediatamente el vial con emulsión homogeneizada de agua en aceite en un evaporador rotativo con un adaptador especial, manómetro y una válvula reguladora de presión. El evaporador debe estar conectado a una línea de vacío para eliminar los disolventes orgánicos. Ajuste la velocidad de rotación a 100 rpm y el vacío a 0,5 atm, y suelte si la espuma de emulsión parece excesiva. Después de que se forme y desaparezca un gel, aumente el vacío a 0.9 atm.NOTA: Durante la eliminación de la fase orgánica volátil, el nivel de vacío debe ajustarse gradualmente, para evitar la formación rápida de espuma, ya que puede conducir a la pérdida de contenido del vial en el cuerpo del evaporador rotativo. Eventualmente, cuando el éter y el cloroformo se evaporan parcialmente y la relación de volumen entre la fase acuosa y la fase solvente orgánica es cercana a 1: 1, se formará un gel. La evaporación debe continuar hasta que el gel desaparezca y los medios acuosos restantes vuelvan a ser completamente líquidos. La mezcla adicional puede ayudar a acelerar la eliminación de disolventes orgánicos. Esto se puede lograr colocando una barra agitadora de politetrafluoroetileno en el matraz de evaporación, para mejorar la convección del gel viscoso durante la evaporación rotativa. Filtre los liposomas resultantes utilizando membranas de policarbonato grabadas en pistas para lograr una distribución homogénea del tamaño.Realice la filtración pasando la dispersión acuosa liposoma hacia adelante y hacia atrás varias veces a través de un filtro de policarbonato de 200 nm de poro en una extrusora liposomal equipada con dos jeringas herméticas al gas.NOTA: Se prefieren jeringas más pequeñas (por ejemplo, 0,5 ml) ya que aseguran la generación de suficiente presión para la filtración. Con un alto contenido de colesterol en la membrana liposómica, no es necesaria una temperatura alta, y el procedimiento se puede realizar a temperatura ambiente. Se realiza un número impar de filtraciones (por ejemplo, 21), de modo que el material resultante termina en el lado opuesto del filtro desde el principio y, si se esteriliza previamente, se puede recolectar la muestra estéril de liposomas de tamaño ajustado filtrado. El tamaño de los liposomas resultantes suele estar cerca del tamaño de poro del filtro seleccionado. Se pueden apilar dos filtros (en lugar de uno) para realizar un ajuste fino para reducir el tamaño de partícula. Verifique la distribución del tamaño mediante la dispersión dinámica de luz láser (DLS)3,4.Agregue de 1 a 3 ml de solución salina a una cubeta de 1 cm con cuatro lados transparentes. A eso, agregue 10\u201220 μL de liposomas y mezcle cuidadosamente. Coloque la muestra en el aparato y seleccione los siguientes parámetros para medir: viscosidad del disolvente, índice de refracción, índice de refracción de los lípidos. Haga clic en el botón Inicio . Las mediciones durarán varios minutos y consistirán en 100 o más carreras. Retire el Ca-acetato externo usando una columna de espín de desalinización. A la mitad del lote, añadir tesaglitazar acuoso en tampón HEPES de 10 mM (pH 7,4) e incubar mezclando a 37 °C durante 1 h. Use la segunda mitad del lote como una formulación de liposomas de control sin medicamentos.NOTA: Preequilibre la columna de centrifugado de desalinización de 2 ml con tampón HEPES de 10 mM, pH 7.4, antes de su uso. Para hacer esto, coloque 1 ml de tampón HEPES en la columna y gire en una centrífuga a 1000 x g durante 2 min. Retire el búfer de paso y repita esto cuatro veces. Eliminar tesaglitazar no atrapado de los liposomas utilizando una columna de espín de 2 ml y determinar la concentración del fármaco atrapado espectrofotométricamente. No agregue más de 0,5 ml de muestra de liposomas al lecho de gel de columna seca y espere hasta que toda la muestra entre en el gel. Centrifugar exactamente en las mismas condiciones que antes (1000 x g, 2 min) y recoger la muestra de liposomas en el paso purificado a partir de pequeños compuestos de masa molecular. Cuantificar las características finales de las partículas: tamaño y concentración de partículas utilizando DLS y potencial zeta conun sistema combinado DLS-electroforectic light scattering (ELS) 3,4 en 10 mM HEPES tampón pH 7.4 y a 25 °C.Similar al paso 1.5.2, diluya la dispersión de liposomas en el tampón de medición (por ejemplo, 10 μL de liposomas por 1 ml de solución tampón) en una cubeta en forma de U usando una jeringa Luer desechable o una pipeta con una punta cortada. Asegúrese de que no haya burbujas en la “U” para que haya una solución ininterrumpida para el flujo de corriente eléctrica. Coloque la cubeta en la unidad (preste atención a la parte delantera y trasera de la cubeta, para que los electrodos estén conectados correctamente a la unidad). Cierre la puerta del instrumento; Después de esto, la medición tiene lugar (con múltiples repeticiones), bajo el control del software de guiado. 2. Preparar los liposomas para la administración in vivo En un gabinete de bioseguridad, diluir los liposomas en solución salina estéril a la concentración apropiada en un volumen final de 50 μL para administración in vivo.NOTA: En estudios previos, nuestra preparación de liposomas contenía 2 mg / ml de tesaglitazar, lo que equivale a aproximadamente 4.89 μmol de tesaglitazar / ml, y administramos liposomas a una dosis de 1 μmol de fármaco / kg. Para un ratón de 40 g, llevaríamos 8,2 μL de liposomas hasta un volumen final de 50 μL en solución salina. Usando DLS/ELS, el número de liposomas por unidad de volumen también debe cuantificarse para las preparaciones de liposomas cargados con fármacos y vehículos para garantizar que se administre un número igual de liposomas vehiculares por gramo de peso de ratón en comparación con los liposomas cargados con fármacos. Cargue la solución de liposomas en una aguja de 27 G en el gabinete de bioseguridad. Mantenga esto a temperatura ambiente para evitar inyectar solución fría en el ratón. 3. Administrar liposomas mediante inyección intravenosa retroorbitaria NOTA: También es apropiado realizar la inyección intravenosa por otros métodos, como inyecciones en la vena de la cola, si se prefiere. Aunque no están cubiertos en este protocolo, los protocolos publicados que explican este método19 están disponibles. Configure el espacio de trabajo para administrar liposomas.Limpie el banco de trabajo con etanol al 70%. Asegúrese de seleccionar un espacio que permita el uso de un sistema de anestesia con isoflurano. Encienda una almohadilla de calentamiento y coloque una almohadilla limpia o una toalla sobre ella para mantener el mouse sobre una superficie limpia. Deje suficiente tiempo para que la almohadilla se caliente antes de comenzar a trabajar con ratones. Configure el sistema de anestesia de modo que la cámara esté cerca y el cono de la nariz esté en la almohadilla de calentamiento.Asegúrese de que todos los demás aspectos del sistema estén listos (por ejemplo, el nivel de isoflurano es lo suficientemente alto en el vaporizador, el filtro de carbón se ha pesado, el tubo está conectado correctamente). Reúna los otros materiales necesarios para esta sección del protocolo: gel lubricante oftálmico, un anestésico local para el tratamiento posterior a la administración, gasas estériles. Sedar al ratón usando isoflurano en la cámara de inducción. Una vez que no responda a un suave toque en el pie, transfiera rápidamente el mouse al espacio de trabajo mientras mantiene la sedación a través de un cono nasal.NOTA: El animal debe mantenerse con isoflurano al 1,5% a 2,5% y evaluarse para una profundidad adecuada de anestesia (a través de la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie) antes de proceder con el procedimiento. Mueva el ratón hacia un lado para la administración de liposomas. Debido a que el ratón no parpadeará mientras está anestesiado, aplique una pequeña cantidad de lubricante oftálmico en ambos ojos para mantenerlos hidratados durante el resto del procedimiento. Presione suavemente sobre la piel por encima y por debajo del ojo expuesto. El ojo debe elevarse por encima del plano de la cara. Inserte cuidadosamente la punta de la aguja en el canto medial, asegurándose de que la aguja esté debajo del ojo y no la toque. Una vez que la aguja se inserta debajo del ojo, inyecte lentamente los liposomas en el espacio retroorbital. Al retirar la aguja, puede ser necesario cerrar los párpados durante unos segundos para lograr la hemostasia.Si la aguja no se inserta lo suficiente, la solución puede emerger alrededor del ojo. Deje de inyectar inmediatamente si esto se ve y vuelva a colocar la aguja. Aplique un anestésico local, como proparacaína, en el ojo para prevenir el dolor y la incomodidad después del procedimiento. Mantenga el mouse en una almohadilla de calentamiento y monitoree hasta que se despierte para asegurarse de que esté bien y mantenga la temperatura corporal adecuada. Devuelva el ratón a su jaula y a su entorno de alojamiento normal hasta que llegue el punto de tiempo de interés.NOTA: Esto debe hacerse de acuerdo con las directrices locales de IACUC. 4. Preparar materiales para la recolección de tejidos, el procesamiento de tejidos y la tinción por citometría de flujo Preparar soluciones para la cosecha, el procesamiento y la tinción (secciones 5-127): solución salina tamponada con fosfato (PBS)-heparina, tampón HEPES, 2 mg/ml de colagenasa tipo I, tampón de lisis AKC, tampón FACS, PBS, tampón de fijación (Tabla 2). Conservar todas las soluciones, excepto el tampón de fijación, a 4 °C o en hielo durante el procedimiento. Prepare tubos con tampones y otros materiales para cosechar y procesar tejidos.Para la sangre de cada ratón, añadir 10 μL de EDTA 0,5 M a un tubo de microcentrífuga de 1,5 o 1,7 ml para recoger la sangre. El EDTA evitará que la sangre se coagule. También se necesita una jeringa de 1 ml con una aguja de 25 G y un tubo cónico de 15 ml. Para el bazo, reúna un tubo de microcentrífuga de 1,5 o 1,7 ml con 1 ml de tampón HEPES, una jeringa de 1 ml, dos tubos cónicos de 50 ml y dos filtros de 70 μm por bazo. Para cada depósito de tejido adiposo, reúna un vial de polietileno de 20 ml con 1,5 ml de tampón HEPES para picar el tejido, un tubo cónico de 50 ml y un filtro de 70 μm por tipo de tejido adiposo por ratón. Prepare el espacio de trabajo para la cosecha.Limpie el espacio del banco con etanol al 70%. Prepare una bandeja de goma para sujetar el ratón durante la cosecha limpiándolo con etanol al 70% y cubriéndolo con una almohadilla absorbente o toallas de papel. Asegúrese de que haya al menos 5 pines disponibles para trabajar. Llene una jeringa de 10 ml con heparina PBS y sujete una aguja de 25 G para perfusión. Reúna herramientas y materiales para usar durante la cosecha. Se necesitan pinzas (dos pares), tijeras, toallas de papel, toallitas sin pelusa, los tubos de microcentrífuga con EDTA, los tubos de microcentrífuga con tampón HEPES y los viales de polietileno con tampón HEPES. 5. Cosecha los tejidos Eutanasia al ratón por asfixia deCO2 . No realice una dislocación cervical, ya que esto puede impedir la recolección efectiva de sangre y la perfusión de tejido en pasos posteriores. En un área de banco limpia con suficiente espacio de trabajo e iluminación para ver bien el ratón, instale una bandeja de disección de goma, un cubo de hielo para almacenar muestras y una botella de spray con etanol al 70%. Rocíe el ratón con etanol al 70% para reducir la contaminación y controlar la propagación del cabello. Coloque el ratón sobre su espalda en la bandeja de goma y fije sus patas extendidas lejos de su cuerpo. Para prepararse para recolectar sangre, haga cuidadosamente una incisión en la piel en el borde del extremo caudal de la caja torácica del ratón. Corte una línea pequeña y recta hacia la cabeza del ratón (aproximadamente 1 cm) hasta que los músculos pectorales estén expuestos.En el sitio de la incisión inicial, haga dos pequeños cortes perpendiculares a la línea hacia la cabeza. Luego, corte cuidadosamente el músculo pectoral en un lado de la caja torácica en el área expuesta. Esto permite un mejor acceso y visualización de dónde se debe insertar la aguja. Para recolectar sangre, inserte la aguja entre la tercera y cuarta costilla en el lado donde se extrajo el músculo. Dado que el corazón del ratón se encuentra en el centro de la cavidad torácica, mantenga la aguja lo más cerca posible de la línea central de la caja torácica. Una vez insertado, tire suavemente de la jeringa para comenzar a recolectar sangre. Una vez recolectada, transfiera la sangre al tubo de microcentrífuga preparado con EDTA y guárdela en hielo.NOTA: Si se extrae aproximadamente 100 μL de volumen y no entra sangre en la jeringa, intente girar la jeringa hacia la derecha o hacia la izquierda en caso de que la abertura de la aguja se presione contra la pared del corazón. Si esto no ayuda, mueva lentamente la aguja más adentro de la cavidad torácica o comience a retirarla. Si la sangre comienza a acumularse en la jeringa en este punto, continúe tirando lentamente de la jeringa. Considere rotar la jeringa y la aguja para una extracción exitosa. Finalmente, si no se recolecta sangre, retire la aguja, ya que puede haber pasado por alto el corazón. Intente volver a insertar la aguja y repetir el proceso mencionado anteriormente. A continuación, para perfundir el ratón, abra la cavidad torácica para acceder al corazón.Para hacer esto, corte la piel a lo largo del extremo de la caja torácica hasta el lado del ratón en cada lado. Luego, use los fórceps para sostener el esternón lejos de la superficie de trabajo. Haga una incisión pequeña y poco profunda justo debajo del extremo del esternón para cortar a través de la cavidad peritoneal. Corte a lo largo de la membrana peritoneal a lo largo del extremo de la caja torácica en cada uno de los lados del ratón. Esto debería exponer el hígado y la vesícula biliar. Tenga cuidado de no cortar ninguno de estos tejidos. Luego, haga un corte pequeño y poco profundo en el diafragma, craneal al hígado. Luego, corte el diafragma a lo largo del borde de la caja torácica para abrir la cavidad torácica. Asegúrese de evitar cortar cualquiera de los órganos dentro de la cavidad torácica. Haga dos cortes a lo largo de la caja torácica hacia la cabeza a unos 2-3 mm de la línea central del ratón y aproximadamente 0,75 cm de largo.NOTA: Si se corta demasiado alto, se cortarán las arterias que residen en la parte superior de la caja torácica. Esto interferirá con la eficacia de la perfusión. Levante hacia atrás la pieza central de la caja torácica para exponer la cavidad torácica. Aleje cualquier grasa o tejido para acceder al corazón. Haga un pequeño corte en la aurícula derecha del corazón del ratón para crear una abertura a través de la cual expulsar la sangre. Con una jeringa de 10 ml de heparina PBS, inserte la aguja en el ventrículo izquierdo del corazón del ratón. Comience suavemente a empujar PBS hacia el corazón lo más lentamente posible.NOTA: Se debe observar sangre emergiendo de las aurículas derechas y llenando la cavidad torácica. Asegúrese de mantener el corazón en su ubicación fisiológica para evitar inhibir el flujo de PBS-heparina desde el corazón a través de la aorta. Una vez que todos los 10 ml de PBS-heparina se hayan perfundido a través del ratón, deseche la jeringa y la aguja y retire el exceso de sangre y PBS-heparina de la cavidad torácica con toallas de papel o toallitas sin pelusa. Luego, para comenzar a extraer tejidos, corte la piel y la membrana peritoneal hacia la cola del ratón para abrir la cavidad peritoneal. Primero, extraiga la almohadilla de tejido adiposo inguinal de cada lado del ratón.NOTA: Lea este proceso cuidadosamente: asegúrese de extraer el ganglio linfático inguinal de cada depósito para evitar sesgar la composición celular del tejido adiposo en los resultados.Usando un segundo juego de fórceps, sostenga la membrana peritoneal con un juego de fórceps y el borde de la piel superpuesto sobre la membrana en ese lado con los otros fórceps. Tire suavemente de la piel de la membrana peritoneal para separar estas capas entre sí. Busque el depósito de tejido adiposo inguinal a lo largo de la piel. Fije el borde exterior de la piel para acceder mejor al depósito adiposo. Antes de la extracción, localice el ganglio linfático inguinal en el centro del depósito adiposo y retírelo con fórceps y tijeras según sea necesario.NOTA: Si es posible, ubique las tres arterias más grandes que van desde los bordes exteriores del depósito hacia el centro. El ganglio linfático se encuentra alrededor de donde se unen estas arterias. Después de extraer el ganglio linfático, sostenga cuidadosamente el extremo del depósito adiposo más cercano al punto fijado con los fórceps y comience a hacer pequeños cortes en la membrana conectiva entre el tejido adiposo y la piel. Levante el tejido adiposo lejos de la piel mientras hace cortes para facilitar el acceso a la membrana y asegurarse de que se extraiga todo el depósito. Coloque el depósito adiposo en un vial de polietileno preparado con tampón HEPES en hielo para mantener el tejido viable durante el resto de la cosecha. Repita este proceso en el otro lado del ratón para extraer ambos depósitos. Los depósitos pueden ser digeridos y procesados juntos o por separado. Si cada depósito se va a procesar por separado, se deben preparar más tubos. A continuación, extraer los depósitos adiposos del epidídimo del extremo caudal de la cavidad peritoneal. Usando fórceps, tire suavemente del primer depósito adiposo epididimario del extremo dorsal del ratón y localice el epidídimo y el conducto deferente unidos a este depósito.NOTA: Hay dos depósitos adiposos epididimarios: uno unido a cada epidídimo y conducto deferente.Cortar cuidadosamente entre el depósito adiposo y el epidídimo y el conducto deferente para separar el tejido adiposo de estos otros tejidos. Coloque el depósito adiposo en un vial de polietileno con tampón HEPES en hielo para mantener el tejido viable durante el resto de la cosecha. Finalmente, extraiga el bazo, que se encuentra a la izquierda del estómago cerca del diafragma. Con fórceps, tire suavemente del estómago hacia el centro de la cavidad peritoneal para exponer el bazo.Sostenga suavemente un extremo del bazo y tire ligeramente lejos del estómago. Corte la membrana entre el bazo y su tejido adyacente hasta que el órgano se desprenda. Coloque el bazo en el tubo de microcentrífuga preparado con tampón HEPES y guárdelo en hielo. Antes de procesar los tejidos o cosechar los tejidos del siguiente ratón, deseche la carcasa y las toallas o almohadillas de papel sucias. Limpie las herramientas también.NOTA: Si hay varios ratones, repita estos pasos de cosecha para cada ratón antes de pasar al siguiente paso de procesamiento. Si se incluye un ratón / ratones de control, considere cosecharlos antes de los ratones tratados con liposomas para evitar cualquier contaminación. 6. Procesar tejidos NOTA: Dado que el tejido adiposo tiene una incubación de digestión larga, se recomienda comenzar con ese proceso primero y trabajar en el procesamiento de la sangre y el bazo durante el período de digestión. Primero, picar y digerir los tejidos adiposos. Usando uno o dos pares de tijeras, picar el tejido adiposo en cada vial de polietileno hasta que el tejido esté en trozos pequeños de menos de 0,5 mm de tamaño. Esto permite una digestión más eficiente.Una vez que los tejidos de todos los viales estén picados, agregue 1,5 ml de tampón de colagenasa de 2 mg/ml a cada vial. Colocar los viales en una incubadora agitadora a 37 °C y 150 rpm. Incubar durante 30 a 45 min.NOTA: Si los tejidos adiposos son particularmente grandes, considere agregar otros 0.5 ml a 1.5 ml de tampón HEPES y un volumen igual de tampón de colagenasa al vial (s) para garantizar que los tejidos estén completamente sumergidos y haya suficiente enzima presente. La concentración final de colagenasa tipo I en la digestión debe ser de 1 mg/ml, independientemente del volumen final de la solución. Además, si no se dispone de una incubadora de agitación, las muestras se pueden colocar en un baño maría calentado a 37 °C. Agitar suavemente las muestras cada 5 min para mezclar y resuspender la digestión. Comprobar las muestras a los 30 min. Use una pipeta de 1 ml para pipetear la muestra hacia arriba y hacia abajo. Si las piezas de tejido aún son demasiado grandes para un pipeteo fácil, devuelva las muestras a la incubadora durante 15 minutos adicionales. Una vez que las muestras estén completamente digeridas, continúe pipeteando la muestra hacia arriba y hacia abajo otras 10 veces para asegurarse de que se haya creado una suspensión de una sola célula.NOTA: (Opcional) Compruebe las muestras a los 30 min. Utilice una pipeta de 1 ml para pipetear la muestra hacia arriba y hacia abajo. Si las piezas de tejido aún son demasiado grandes para un pipeteo fácil, devuelva las muestras a la incubadora durante 15 minutos adicionales. Pipet la suspensión celular a través de un filtro de 70 μm en un tubo cónico de 50 ml. Añadir 5 ml de tampón FACS al vial de digestión vacío para lavar el vial. Transfiera este tampón de lavado a través del filtro para agregarlo a la suspensión celular. Almacene las muestras en hielo mientras se procesan otras. Una vez filtradas todas las muestras, hiéralas girar hacia abajo a 400 x g, 4 °C durante 5 min. Retire el sobrenadante de adipocitos por aspiración y luego retire cuidadosamente el infranadante entre el sobrenadante de adipocitos y el pellet por aspiración para dejar el pellet de fracción estromal vascular (SVF). Vuelva a suspender este pellet en 1 ml de tampón FACS y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 o 1,7 ml. Células alícuotas ahora si se desea o se necesita. Mantener en hielo hasta que todas las muestras estén listas para la tinción por citometría de flujo.NOTA: Si los depósitos adiposos digeridos fueran grandes, considere usar solo el 50% o 25% de la muestra para la tinción y el análisis de la citometría de flujo. Además, si se necesitan controles de fluorescencia menos uno (FMO) o controles adicionales para el análisis de citometría de flujo (Tabla 1), asegúrese de alícuota la muestra adicional en un tubo separado para su procesamiento. Los FMO se utilizan para distinguir entre la señal negativa y positiva para un anticuerpo individual conjugado con fluoróforos dentro del panel completo utilizado en el experimento. Segundo, procesa la sangre.Transfiera 50 μL de sangre a un tubo cónico de 15 ml. Agregue 1 ml de tampón de lisis AKC a cada tubo y pipete hacia arriba y hacia abajo para alcanzar una suspensión de una sola celda. Agregue 4 ml adicionales de tampón de lisis AKC a cada tubo e incube durante 5\u201210 min. Si hay un agitador o rotador disponible, selle las tapas del tubo herméticamente y coloque los tubos en uno de estos para mejorar la mezcla. Añadir 5 ml de tampón FACS para apagar el proceso de lisis y centrifugar las muestras a 400 x g, 4 °C durante 5 min. Retire el sobrenadante y compruebe el pellet. Si todavía está bastante rojo, repita el proceso de lisis. De lo contrario, vuelva a suspender los gránulos en 1 ml de tampón FACS y transfiéralos a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 o 1,7 ml. Mantener en hielo hasta que todas las muestras estén listas para la tinción por citometría de flujo. Finalmente, procesa el bazo. Transfiera el bazo a un filtro de 70 μm sobre un tubo cónico de 50 ml. Lave el tejido con 1 ml de tampón FACS y luego triture el bazo a través del filtro usando el extremo del émbolo de una jeringa de 1 ml. A lo largo del proceso de maceración, lave las células en el tubo cónico de 50 ml utilizando más tampón FACS. El volumen final en el tubo cónico debe ser de 10 ml.Girar las celdas a 300 x g a 4 °C durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender en 1 ml de tampón de lisis AKC. Agregue 4 ml adicionales de tampón de lisis AKC e incube durante 5 min. Añadir 5 ml de tampón FACS para apagar el proceso de lisis y girar las muestras a 300 x g a 4 °C durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de tampón FACS. Transfiera la suspensión a través de un segundo filtro limpio de 70 μm a un tubo cónico de 50 ml. Agregue 4 ml de tampón FACS para lavar el tubo original y transfiera el tampón a través del filtro para obtener un volumen final de 5 ml. Transfiera 50 μL de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 o 1,7 ml y manténgalo en hielo hasta que todas las muestras estén listas para la tinción por citometría de flujo. Se pueden transferir alícuotas adicionales a los tubos si se desean o requieren más.NOTA: Los esplenocitos son excelentes células para usar en una tinción única viva / muerta. Considere la posibilidad de transferir una alícuota adicional para este control. 7. Teñir células de tejidos para citometría de flujo Girar muestras alícitas a 400 x g, 4 °C durante 5 min. Retirar sobrenadante y resuspender las muestras en 50 μL de Fc Block (diluido) (Tabla 2). Incubar en hielo durante 5 min. Añadir 50 μL de mezcla de anticuerpos 2x (Tabla 3) a cada muestra. Incubar en hielo en la oscuridad durante 20 min.NOTA: Cualquier tinción individual NO debe teñirse con esta mezcla de anticuerpos. Además, si se van a utilizar FMO, las mezclas de anticuerpos FMO deben prepararse por separado. Lavar las muestras con 1 ml de PBS y centrifugar a 400 x g, 4 °C durante 5 min. Retirar el sobrenadante y resuspender las muestras en 200 μL de tinción de viabilidad (Tabla 3). Incubar en hielo en la oscuridad durante 20 min.NOTA: No olvide teñir las células que se reservaron para una sola tinción Vivo / Muerto durante este paso. Lavar las muestras con 1 ml de tampón FACS y centrifugar a 400 x g, 4 °C durante 5 min. Retirar el sobrenadante y resuspender las muestras (excepto la tinción única viva/muerta) en 50 μL de medio de fijación (reactivo A) para fijar las muestras. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 min.Resuspender la tinción única Live/Dead en 100 μL de PFA al 2%. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 5 min. Lavar la muestra con 1 ml de tampón FACS y centrifugar a 800 x g, 4 °C durante 5 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender las muestras en 250 a 500 μL de tampón FACS. Conservar a 4 °C hasta que las muestras puedan funcionar en el citómetro de flujo. Lavar las muestras con 1 ml de tampón FACS y centrifugar a 800 x g, 4 °C durante 5 min. Extraer el sobrenadante y resuspender las muestras en 50 μL de medio de permeabilización (Reactivo B) más anticuerpo/s contra proteínas intracelulares. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 min. Lavar las muestras con 1 ml de tampón FACS y centrifugar a 800 x g a 4 °C durante 5 min. Retirar el sobrenadante y resuspender las muestras en 100 μL de paraformaldehído (PFA) al 2%. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 5 min. Lavar las muestras con 1 ml de tampón FACS y centrifugar a 800 x g, 4 °C durante 5 min. Retirar el sobrenadante y resuspender las muestras en 250 a 500 μL de tampón FACS. Conservar a 4 °C hasta que las muestras puedan funcionar en el citómetro de flujo.