الهدف من هذا البروتوكول هو توليف الجسيمات الشحمية ذات العلامات الفلورية واستخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد توطين الجسيمات الشحمية في الجسم الحي على المستوى الخلوي.
هناك اهتمام متزايد باستخدام الجسيمات الشحمية لتوصيل المركبات في الجسم الحي خاصة لأساليب العلاج المستهدفة. اعتمادا على تركيبة الجسيمات الشحمية ، قد يتم تناول الجسيمات الشحمية بشكل تفضيلي من قبل أنواع مختلفة من الخلايا في الجسم. قد يؤثر هذا على فعالية الجسيم العلاجي لأن تطور الأمراض المختلفة خاص بالأنسجة ونوع الخلية. في هذا البروتوكول ، نقدم طريقة واحدة لتجميع وتسمية الجسيمات الشحمية بالفلورسنت باستخدام DSPC والكوليسترول و PEG-2000 DSPE وصبغة الدهون DiD كملصق فلوريسنت. يقدم هذا البروتوكول أيضا نهجا لتوصيل الجسيمات الشحمية في الجسم الحي وتقييم امتصاص الجسيمات الشحمية الخاصة بالخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي. يمكن استخدام هذا النهج لتحديد أنواع الخلايا التي تمتص الجسيمات الشحمية وتحديد توزيع ونسبة امتصاص الجسيمات الشحمية عبر أنواع الخلايا والأنسجة. على الرغم من عدم ذكرها في هذا البروتوكول ، فإن المقايسات الإضافية مثل التألق المناعي والتصوير الفلوري أحادي الخلية على مقياس الخلايا ستعزز أي نتائج أو استنتاجات يتم التوصل إليها لأنها تسمح بتقييم التلوين داخل الخلايا. قد تحتاج البروتوكولات أيضا إلى التكيف اعتمادا على الأنسجة (الأنسجة) ذات الأهمية.
مع تزايد الاهتمام بتطوير العلاجات التي تستخدم توصيل أدوية الجسيمات النانوية ، يجب أن تستمر طرق إعداد وتقييم توزيع الجسيمات وامتصاصها في التقدم والتوسع وتكون في متناول مجتمع البحث 1,2. تم تطوير هذا البروتوكول لتقييم أنواع الخلايا الدقيقة التي تناولت الجسيمات الشحمية في الجسم الحي بعد العلاج بالليبوزومات التي تحمل علامة DiD المحملة ب tesaglitazar ، وهو ناهض نشط لمستقبلات البيروكسيسوم المنشط (PPAR) -α / γ 3,4. في هذه الدراسات ، تمكنا من تقييم أنواع الخلايا التي تأثرت بشكل مباشر بعلاج tesaglitazar الشحمي ، وفعالية استهداف الشقوق ، وتوليد فرضيات لشرح نتائج العلاج التي لاحظناها. علاوة على ذلك ، تشير الوظائف البيولوجية الراسخة في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا إلى أن الخلايا البلعمية مثل الضامة والخلايا المتغصنة وخلايا كوبفر الخاصة بالكبد تمتص معظم الجسيمات الشحمية5،6،7. باستخدام هذا البروتوكول ، أثبتنا أن الخلايا البلعمية غير الكلاسيكية يمكن أن تمتص أيضا الجسيمات الشحمية 3,4.
يقدم هذا البروتوكول طريقة محسنة لإذابة tesaglitazar ، وإعداد الجسيمات الشحمية عن طريق تبخر الطور العكسي ، واستخدام أسيتات الكالسيوم كعامل جذب لتحميل الأدوية عن بعد. الطرق المقدمة متاحة للعديد من المختبرات وتفتقر إلى المواد التي يصعب الحصول عليها والخطوات التي تتطلب درجات حرارة عالية. ينتج البروتوكول الجسيمات الشحمية ذات الأحجام المثلى لزيادة الدورة الدموية في الجسم الحي8. علاوة على ذلك ، كما لخص Su et al. ، حتى الآن ، تمت دراسة طرق تقييم توزيع الجسيمات الشحمية في الجسم الحي وامتصاص الأنسجة واختبارها بعمق9. يتم تطبيق طرق التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) والتصوير المقطعي الجزيئي الفلوري (FMT) لتحديد التوزيع الحيوي الخاص بالأنسجة وامتصاص9،10،11. في حين تم تحسين هذه الطرق لتحقيق أقصى قدر من الكشف في الجسم الحي ، إلا أنها لا تزال تفتقر إلى القدرة على تحديد امتصاص الجسيمات الشحمية في الجسم الحي بدقة خلوية. يهدف البروتوكول المقدم هنا إلى تلبية هذه الحاجة من خلال استخدام قياس التدفق الخلوي. أخيرا ، بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم تضييق امتصاص الخلايا إلى عدد قليل من الأنسجة بما في ذلك الأنسجة الدهنية. هناك مجموعة متزايدة من الأدبيات التي تبحث في إمكانية استخدام الجسيمات النانوية لتقديم العلاجات في وضع السمنة ، وخلل التمثيل الغذائي ، والالتهابات12،13،14،15،16،17. على هذا النحو ، شعرنا أنه من المهم مشاركة بروتوكول مع طرق فعالة لمعالجة وتحليل الأنسجة الدهنية – أحد الأنسجة التي تلعب دورا مهما في هذه الأمراض.
هنا نصف بروتوكولا مكونا من ثلاثة أجزاء ل (i) تحضير الجسيمات الشحمية التي تحمل صبغة دهنية فلورية ومحملة بمركب مضاد للسكري ، tesaglitazar ، (ii) إعطاء الجسيمات الشحمية للفأر عن طريق الحقن المداري الخلفي ، و (iii) حصاد الأنسجة ومعالجتها وتلطيخها للكشف عن امتصاص الجسيمات الشحمية على المستوى الخلوي عن طريق قياس التدفق الخلوي. يستعرض هذا البروتوكول تحضير ما يقرب من 150 ميكرومتر من الجسيمات الشحمية وتقييم امتصاص الدهون والدم والطحال. يعد تحضير الجسيمات الشحمية قابلا للتطوير ، ويتم إجراؤه في الغالب في درجة حرارة الغرفة ، ويستخدم تبخر الطور العكسي لزيادة تحميل الدواء وإزالة المذيبات العضوية. باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن تحقيق تركيز tesaglitazar يصل إلى 2 مجم / مل في عينة الجسيمات الشحمية المنقى. يمكن تخزين الجسيمات الشحمية المحضرة في مخزن HEPES المؤقت عند 4 درجات مئوية لأكثر من عام. في تجربتنا ، أظهروا الحد الأدنى من التباين في متوسط حجم الجسيمات. تم إثبات أقل من 10٪ من فقدان محتوى الدواء طيفيا ، بعد فصل الترشيح الفائق للجسيمات الشحمية عن الدواء الخارجي باستخدام مرشح طرد مركزي 10 كيلو دالتون.
أثناء تحضير الجسيمات الشحمية ، هناك بعض الخطوات والعوامل الحاسمة التي يجب مراعاتها. أولا ، ترتيب خطوات البروتوكول مهم ويجب الالتزام به. ثانيا ، يجب الحفاظ على الرقم الهيدروجيني للمحلول المستخدم عند تحميل tesaglitazar عند 7.4 من أجل زيادة الذوبان والتحميل الفعال. ثالثا ، يضمن التجميع الصحيح للمعدات والمرشحات أن يكون ناتج كل خطوة بالحجم والنقاء المناسبين. على سبيل المثال ، إذا لم يتم تجميع مرشحات 100 و 200 نانومتر بشكل صحيح ، فقد ينتج عن ذلك مجموعة أكثر تجانسا وغير مناسبة الحجم من الجسيمات الشحمية. رابعا ، هناك حاجة إلى الإزالة الكاملة لأسيتات الكالسيوم قبل تحميل الدواء لتحقيق أقصى قدر من نقل tesaglitazar إلى الجسيمات الشحمية. لاختبار الإزالة الكاملة لأسيتات الكالسيوم ، استخدم الترسيب عالي السرعة لإزالة الجسيمات الشحمية ثم قياس مستويات خلات الكالسيوم في المحلول غير الشحمي. خامسا ، من المهم وزن وتسجيل كتلة جميع المواد المضافة إلى إعداد الجسيمات الشحمية في كل خطوة. هذا يضمن إمكانية حساب التركيزات المناسبة والحفاظ على النسب المطلوبة من المواد. أخيرا ، إذا لم يتم تنفيذ التقنية بشكل صحيح ، فقد يكون هناك مستوى غير مرغوب فيه من عدم التجانس. من المهم التحقق بدقة من هذه المعلمة باستخدام DLS وطرق أخرى مثل المجهر الإلكتروني. لتحسين التجانس ، ضع في اعتبارك ضبط حجم المرشح المحدد أو تكديس مرشحين.
بالإضافة إلى ذلك ، من الأهمية بمكان أن يتم تخطيط وتحسين عناصر التحكم ولوحة الأجسام المضادة لقياس التدفق الخلوي قبل إجراء هذا البروتوكول بالكامل (الجدول 1 ، الجدول 3). يجب اختبار الأجسام المضادة لضمان استخدام التركيزات المناسبة للتلطيخ وأن التداخل بين الفلوروفورات ضئيل. يجب أيضا مراعاة إثارة وانبعاث الصبغة المستخدمة أثناء تحضير الجسيمات الشحمية في تخطيط اللوحة. في نتائجنا ، استخدمنا DiD ، الذي له إثارة وانبعاث مماثل للفلوروفورات مثل Allophycocyanin (APC) و AlexaFluor 647. وبالتالي ، لم نختار الأجسام المضادة المترافقة مع هذه الفلوروفورات في لوحة الأجسام المضادة الخاصة بنا. علاوة على ذلك ، لا يتم تضمين ضوابط النمط المتماثل في هذا البروتوكول. وذلك لأن الأجسام المضادة المختارة لهذا البروتوكول هي أجسام مضادة مثبتة جيدا ومتاحة تجاريا. ومع ذلك ، إذا كنت مهتما باستخدام جسم مضاد لم يتم تحسينه من قبل ، فيرجى التفكير في اختبار الجسم المضاد مقابل التحكم في النمط المتماثل على الأنسجة ذات الاهتمام قبل إجراء التجربة الكاملة.
بينما يوضح هذا البروتوكول كيفية استخراج ومعالجة الدم والطحال والأنسجة الدهنية الأربية والبربخ من الفأر بعد العلاج ، يمكن تطبيق هذا النهج العام على الأنسجة الأخرى. اعتمادا على الأنسجة ذات الأهمية ، قد تحتاج بروتوكولات المعالجة والهضم إلى التغيير كما هو منشور للأنسجة التالية: الرئة21 ، الكبد 22 ، التجويف البريتوني 3 ، نخاع العظام3،23 ، الدماغ 24.
أحد القيود المهمة لهذه الطريقة التي يجب مراعاتها هو أنه لا يمكن تقييم الامتصاص إلا في نقطة زمنية واحدة لكل. وبالتالي ، قد يكون من المفيد إقران هذا البروتوكول بتقنيات التصوير غير الغازية الأخرى أو التخطيط وفقا لذلك لضمان الموارد الكافية لإجراء التقييم. يعد توقيت الامتصاص الخلوي ودوران الخلايا من العوامل المهمة التي يجب مراعاتها: سوف تنتشر الجسيمات الشحمية في جميع أنحاء الجسم في أول 24 ساعة واعتمادا على عمر الخلايا التي تمتص الجسيمات الشحمية أو كيفية استجابتها للامتصاص ، قد يحدث موت الخلايا أو المزيد من البلعمة. أظهرت دراستنا السابقة تغيرات في الخصائص السكانية لمجموعات DiD + في نقاط زمنية مختلفة3. لهذا السبب ، من المهم تقييم الاستيعاب في نقاط زمنية مبكرة أو نقاط زمنية أكثر صلة ببيولوجيا آلية الاهتمام. بالإضافة إلى ذلك ، في حين يمكن إجراء القياس الكمي لامتصاص الخلايا في الأنسجة بأكملها باستخدام هذا البروتوكول ، لا يمكن أن يكشف قياس التدفق الخلوي عن توطين الأنسجة. يمكن أن يساعد اقتران هذا النهج بالأساليب النسيجية في معالجة هذا القيد.
بشكل عام ، يكمل هذا البروتوكول المنهجية الحالية مثل علم الأنسجة والتصوير الفلوري لكامل الجسم. مع التقدم المستمر في أدوات وأساليب قياس التدفق الخلوي ، سيصبح تطوير لوحات أكبر إلى مجموعات خلايا أكثر وأكثر تحديدا ممكنا. نقترح استخدام هذا البروتوكول بالإضافة إلى الطرق المذكورة أعلاه لأن هذا سيحسن تقييم الامتصاص الخلوي ويوفر أيضا الفرصة للتحقق من صحة النتائج التي لوحظها قياس التدفق الخلوي. على سبيل المثال ، إذا وجد أن غالبية الجسيمات في الأنسجة الدهنية قد تم تناولها بواسطة البلاعم عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن حفظ التألق المناعي لقسمة إضافية من نفس الأنسجة الدهنية وتثبيتها وتقسيمها وتلطيخها لعلامات البلاعم للتحقق من أن نوع الخلية يمتص بالفعل الجسيمات الشحمية. يجب أن يضيف هذا النهج صرامة إلى فحوصات التوزيع الحيوي للجسيمات النانوية التي يتم إجراؤها: التحقق من صحة الاستهداف الخاص بالخلية ، وتحديد الامتصاص الخلوي ، وتحديد الامتصاص خارج الهدف ، ونأمل في توفير معلومات لتوليد فرضيات ميكانيكية للنتائج العلاجية المرصودة. يمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول للدراسات المستقبلية باستخدام الجسيمات الشحمية المختلفة ، والتحقيق في امتصاص الأنسجة الأخرى ، واختبار مركبات جديدة في وضع السمنة وخلل التمثيل الغذائي أو أي مرض آخر يكون فيه توصيل الجسيمات النانوية خيارا علاجيا مجديا.
The authors have nothing to disclose.
يود المؤلفون أن يشكروا مايكل سولجا وبقية موظفي Flow Cytometry Core على توفير التدريب والخدمات على قياس التدفق الخلوي. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا شيفا ساي كريشنا داسا ، وداستن ك. بوكنايت ، وميليسا أ. مارشال ، وجيمس سي جارمي ، وشانتيل ماكسيمينج ، وأديتي أوبادهي ، وبراساد سريكاكولابو لمساعدتهم في تحضير الجسيمات الشحمية (SSKD ، DKB) ، وحصاد الأنسجة (MAM ، JCG) ، وتلطيخ قياس التدفق الخلوي والحصول على العينات (AU ، PS ، CM). تم دعم هذا العمل من خلال منح AstraZeneca و R01HL 136098 و R01HL 141123 و R01HL 148109 و AHA 16PRE30770007 و T32 HL007284.
1-mL syringe | BD | 309659 | |
10-mL syringe | BD | 302995 | |
25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305122 | |
27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305620 | |
Anti-mouse B220 BV421 | Biolegend | 103251 | Clone RA3-6B2 |
Anti-mouse CD115 PE | eBioscience | 12-1152-82 | Clone AFS98 |
Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody | BD Biosciences | 550993 | Clone M1/70 |
Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody | eBioscience | 47-0114-82 | Clone N418 |
Anti-mouse CD19 PE CF594 | BD Biosciences | 562291 | Clone 1D3 |
Anti-mouse CD3 FITC antibody | BD Biosciences | 553061 | Clone 145-2C11 |
Anti-mouse CD31 BV605 | Biolegend | 102427 | Clone 390 |
Anti-mouse CD45 PerCP | BD Biosciences | 557235 | Clone 30-F11 |
Anti-mouse F4/80 PE Cy7 | Biolegend | 123114 | Clone BM8 |
Bovine serum albumin | Gemini Bio-products | 700-107P | |
Desalting spin-column | ThermoFisher | 89889, 89890 | Zeba spin column |
DPBS | Gibco | 14190-144 | |
Dynamic Light Scattering, Nicomp 370 | Particle Sizing System, Inc | ||
FIX & PERM Cell Permeabilization Kit | ThermoFisher Scientific | GAS004 | |
Gauze sponges | Dermacea | 441211 | |
Heparin | Sigma | 3393-1MU | |
Liposome extruder | Millipore Sigma | Z373400 | LiposoFast |
Live/Dead Aqua | ThermoFisher Scientific | L34957 | |
Nanosight | Malvern Instruments Ltd | NS300 | |
Ophthalmic lubricant | Optixcare | 20g/70 oz Sterile | |
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 433689L | |
Polyethylene vial for mincing | Wheaton | 986701 | |
Rotary evaporator | Buchi | Re111 | |
Sonicator | Misonix | XL2020 | |
T/Pump Heat therapy pump and pad | Gaymer Industries | TP-500 | |
Tesaglitazar | Tocris | 3965 | |
Track-etched polycarbonate membranes | Thomas Scientific | 1141Z** | Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes |
ZetaSizer/DLS-ELS system | Malvern Instruments Ltd |