该协议的目标是合成荧光标记的脂质体,并使用流式细胞术在细胞水平上鉴定脂质体的体内定位。
人们对使用脂质体在体内递送化合物的兴趣日益浓厚,特别是对于靶向治疗方法。根据脂质体配方,脂质体可以优先被体内不同的细胞类型吸收。这可能会影响治疗颗粒的疗效,因为不同疾病的进展是组织和细胞类型特异性的。在该协议中,我们提出了一种使用DSPC,胆固醇和PEG-2000 DSPE以及脂质染料DiD作为荧光标记合成和荧光标记脂质体的方法。该协议还提供了一种在体内递送脂质体和使用流式细胞术评估脂质体的细胞特异性摄取的方法。这种方法可用于确定吸收脂质体的细胞类型,并量化脂质体摄取在细胞类型和组织中的分布和比例。虽然本协议中未提及,但额外的测定(例如细胞仪上的免疫荧光和单细胞荧光成像)将加强所做的任何发现或结论,因为它们允许评估细胞内染色。方案可能还需要根据感兴趣的组织进行调整。
随着对开发利用纳米颗粒药物递送的疗法的兴趣不断增长,制备和评估颗粒分布和摄取的方法必须继续推进,扩展,并为研究界所用1,2。该协议旨在评估在用装有tesaglitazar(一种过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-α/γ激动剂3,4)的DiD标记脂质体处理后在体内吸收脂质体的确切细胞类型。在这些研究中,我们能够评估脂质体tesaglitazar治疗直接影响哪些细胞类型,靶向部分的功效,并生成假设来解释我们观察到的治疗结果。此外,在多种细胞类型中建立的生物学功能表明吞噬细胞如巨噬细胞、树突状细胞和肝脏特异性库普弗细胞占据了大部分脂质体5,6,7。利用该协议,我们已经证明非经典吞噬细胞也可以吸收脂质体3,4。
该协议提供了一种优化的方法,用于溶解tesaglitazar,通过反相蒸发制备脂质体,并使用醋酸钙作为远程药物加载的引诱剂。所提供的方法可供许多实验室使用,并且缺乏难以获得的材料和需要高温的步骤。该方案产生大小的脂质体,最适合增加体内循环8。此外,正如Su等人所总结的那样,迄今为止,已经对评估体内脂质体分布和组织摄取的方法进行了深入研究和测试9。正电子发射断层扫描(PET),磁共振成像(MRI)和荧光分子断层扫描(FMT)方法用于量化组织特异性生物分布和摄取9,10,11。虽然这些方法已经过优化以最大限度地提高体内检测率,但它们仍然缺乏以细胞分辨率量化体内脂质体摄取的能力。这里介绍的方案旨在通过使用流式细胞术来满足这一需求。最后,对于该协议,细胞摄取缩小到包括脂肪组织在内的一些组织。越来越多的文献调查了在肥胖,代谢障碍和炎症的情况下使用纳米颗粒提供治疗的潜力12,13,14,15,16,17。因此,我们认为与处理和分析脂肪组织的有效方法共享协议很重要 – 脂肪组织是在这些病理中起重要作用的组织之一。
在这里,我们描述了一个由三部分组成的方案,用于(i)制备用荧光脂质染料标记并加载有抗糖尿病化合物tesaglitazar的脂质体,(ii)通过眶后注射将脂质体施用于小鼠,以及(iii)收获,处理和染色组织以通过流式细胞术检测细胞水平的脂质体摄取。该协议回顾了大约150μm脂质体的制备和脂肪,血液和脾脏摄取的评估。脂质体制备是可扩展的,主要在室温下进行,并利用反相蒸发来最大化药物负载和有机溶剂的去除。使用该协议,纯化的脂质体样品中可以达到高达2 mg / mL的tesaglitazar浓度。制备的脂质体可以在4°C的HEPES缓冲液中储存一年以上。根据我们的经验,它们证明了平均粒径的最小变化。在用10 kDa离心过滤器超滤分离脂质体与外部药物后,通过分光光度法证明了低于10%的药物含量损失。
在脂质体制备过程中,需要考虑一些关键步骤和因素。首先,协议步骤的顺序很重要,必须遵守。其次,上样替格列塔扎时所用溶液的pH值必须保持在7.4,以最大限度地提高溶解度和有效上样量。第三,设备和过滤器的正确组装确保每个步骤的输出具有适当的尺寸和纯度。例如,如果 100 纳米和 200 纳米滤光片组装不当,则可能会导致一批异质性和尺寸不合适的脂质体。第四,需要在载药前完全去除醋酸钙,以最大限度地将替格列塔唑转移到脂质体中。要测试乙酸钙的完全去除,请使用高速沉降去除脂质体,然后测量非脂质体溶液中的乙酸钙水平。第五,重要的是在每一步称重并记录添加到脂质体制剂中的所有材料的质量。这确保了可以计算出适当的浓度并保持所需的材料比例。最后,如果技术执行不当,则可能存在不希望的异质性水平。使用DLS和其他方法(如电子显微镜)彻底检查此参数非常重要。要提高均匀性,请考虑调整所选过滤器尺寸或堆叠两个过滤器。
此外,在完全实施此方案之前,计划和优化流式细胞术的对照和抗体组合至关重要(表1, 表3)。应检测抗体,以确保使用适当的浓度进行染色,并且荧光团之间的重叠最小。脂质体制备过程中所用染料的激发和发射也必须考虑在组合规划中。在我们的结果中,我们使用了DiD,它与异藻蓝蛋白(APC)和AlexaFluor 647等荧光团具有相似的激发和发射。因此,我们没有在抗体组合中选择与这些荧光团偶联的抗体。此外,同种型对照不包括在该协议中。这是因为为该方案选择的抗体是经过充分验证的市售抗体。但是,如果有兴趣使用以前未优化的抗体,请考虑在进行完整实验之前对感兴趣的组织进行针对同种型对照的抗体测试。
虽然该协议演示了如何从小鼠治疗后提取和处理血液,脾脏,腹股沟脂肪和附睾脂肪组织,但这种通用方法可以应用于其他组织。根据感兴趣的组织,可能需要改变以下组织的处理和消化方案:肺21,肝22,腹膜腔3,骨髓3,23,脑24。
这种方法的一个重要局限性是,每只动物只能在一个时间点评估摄取。因此,将该协议与其他非侵入性成像技术相结合或相应地计划以确保有足够的资源进行评估可能是有利的。细胞摄取和细胞周转的时间是需要考虑的重要因素:脂质体将在前24小时内在全身循环,并且取决于吸收脂质体的细胞的寿命或它们对摄取的反应,可能会发生细胞死亡或进一步吞噬作用。我们之前的研究表明,DiD+ 种群在不同时间点的种群特征发生了变化3。因此,评估较早的时间点或与目的机制生物学最相关的时间点的摄取非常重要。此外,虽然可以使用该协议对整个组织中的细胞摄取进行定量,但流式细胞术不能揭示组织定位。将这种方法与组织学方法相结合有助于解决这一限制。
通常,该协议补充了现有方法,例如组织学和全身荧光成像。随着流式细胞术工具和方法的不断进步,为越来越多的特异性细胞群开发更大的组合将成为可能。我们建议在上述方法之外使用该协议,因为这将改善细胞摄取的评估,并提供验证流式细胞术观察到的结果的机会。例如,是否应该发现脂肪组织中的大部分颗粒被流式细胞术的巨噬细胞吸收。可以保存,固定,切片和染色相同脂肪组织的额外等分试样的免疫荧光以获取巨噬细胞标志物,以验证细胞类型确实吸收脂质体。这种方法应该增加纳米颗粒生物分布测定的严谨性:验证细胞特异性靶向,量化细胞摄取,识别脱靶摄取,并希望提供信息以产生观察到的治疗结果的机制假设。该协议也可以适用于使用不同脂质体的未来研究,研究其他组织中的摄取,以及在肥胖和代谢障碍或任何其他疾病的情况下测试新化合物,其中纳米颗粒递送是一种可行的治疗选择。
The authors have nothing to disclose.
作者要感谢Michael Solga和其他流式细胞术核心工作人员提供流式细胞术培训和服务。作者还要感谢Shiva Sai Krishna Dasa,Dustin K. Bauknight,Melissa A. Marshall,James C. Garmey,Chantel McSkimming,Aditi Upadhye和Prasad Srikakulapu在脂质体制备(SSKD,DKB),组织收获(MAM,JCG)以及流式细胞术染色和样品采集(AU,PS,CM)方面的帮助。这项工作得到了阿斯利康,R01HL 136098,R01HL 141123和R01HL 148109,AHA 16PRE30770007和T32 HL007284资助的支持。
1-mL syringe | BD | 309659 | |
10-mL syringe | BD | 302995 | |
25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305122 | |
27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection | BD | 305620 | |
Anti-mouse B220 BV421 | Biolegend | 103251 | Clone RA3-6B2 |
Anti-mouse CD115 PE | eBioscience | 12-1152-82 | Clone AFS98 |
Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody | BD Biosciences | 550993 | Clone M1/70 |
Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody | eBioscience | 47-0114-82 | Clone N418 |
Anti-mouse CD19 PE CF594 | BD Biosciences | 562291 | Clone 1D3 |
Anti-mouse CD3 FITC antibody | BD Biosciences | 553061 | Clone 145-2C11 |
Anti-mouse CD31 BV605 | Biolegend | 102427 | Clone 390 |
Anti-mouse CD45 PerCP | BD Biosciences | 557235 | Clone 30-F11 |
Anti-mouse F4/80 PE Cy7 | Biolegend | 123114 | Clone BM8 |
Bovine serum albumin | Gemini Bio-products | 700-107P | |
Desalting spin-column | ThermoFisher | 89889, 89890 | Zeba spin column |
DPBS | Gibco | 14190-144 | |
Dynamic Light Scattering, Nicomp 370 | Particle Sizing System, Inc | ||
FIX & PERM Cell Permeabilization Kit | ThermoFisher Scientific | GAS004 | |
Gauze sponges | Dermacea | 441211 | |
Heparin | Sigma | 3393-1MU | |
Liposome extruder | Millipore Sigma | Z373400 | LiposoFast |
Live/Dead Aqua | ThermoFisher Scientific | L34957 | |
Nanosight | Malvern Instruments Ltd | NS300 | |
Ophthalmic lubricant | Optixcare | 20g/70 oz Sterile | |
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free | Alfa Aesar | 433689L | |
Polyethylene vial for mincing | Wheaton | 986701 | |
Rotary evaporator | Buchi | Re111 | |
Sonicator | Misonix | XL2020 | |
T/Pump Heat therapy pump and pad | Gaymer Industries | TP-500 | |
Tesaglitazar | Tocris | 3965 | |
Track-etched polycarbonate membranes | Thomas Scientific | 1141Z** | Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes |
ZetaSizer/DLS-ELS system | Malvern Instruments Ltd |